玩转单细胞高级分析 | 细胞轨迹分析篇

随着单细胞测序技术的飞速发展和相应分析工具的大量出现，单细胞测序的应用逐渐走向成熟，能解决的生物学问题也越来越广泛。如何选择各式各样的高级分析让自己的单细胞研究锦上添花，为许多科研工作者带来了烦恼。

细胞轨迹分析可以通过构建细胞间的变化轨迹来重塑细胞随着时间的变化过程，帮助人们从单细胞水平推断细胞之间的演化及分化过程，下面就梳理下细胞轨迹分析的原理及应用思路。

一、细胞轨迹分析常用方法

常见的单细胞轨迹研究方法包括拟时序分析及RNA 速率分析（RNA velocity）等，广泛应用于发育研究，干细胞分化及肿瘤微环境免疫细胞的动态变化研究等。

1.拟时序分析

拟时序分析可以根据每个细胞的时序基因表达，将每个细胞按照拟时间排列在对应轨迹上，根据基因的表达状况把样本分为多个分化状态下的细胞群（State），生成直观的谱系发育树状图，可以预测细胞的分化及发育轨迹。拟时序分析的结果需要根据细胞类型的轨迹分布及特征基因的表达变化来确认分化起点和终点。

图1 Monocle拟时序分析结果

2. RNA速率分析

RNA 速率分析通过拟合前体（未剪接的）和成熟（剪接的）mRNA 丰度之间的比值来获得基因特异性速度，得出可能的细胞状态变化，从而追溯细胞的起源和潜在的命运，RNA 速率分析不需要指定起点和终点。

图2 RNA velocity细胞速率分析结果

二、细胞轨迹分析应用思路

细胞轨迹分析可以验证单细胞分辨率的已知的细胞分化关系，揭示细胞发育轨迹，挖掘肿瘤免疫细胞动态变化，挖掘分化关键的细胞亚群及基因。

1.验证已知的发育关系

对于已知分化关系的发育研究，可以通过拟时序分析验证之前的发育轨迹。2020年美国犹他大学医学院等单位的研究人员在Cell Stem Cell发表了人类胚胎期和出生早期的睾丸组织发育的单细胞图谱文章。该研究挑选睾丸组织中生殖细胞亚群进行细分，根据生殖细胞发育相关基因表达情况，将生殖细胞亚群分为4个发展阶段：未分化的精原细胞（UTF1+ MKI67–），分化的精原细胞（KIT+ MKI67+），初级精母细胞（STRA8+ GPR85+），精子细胞（PRM3+）。通过Monocle拟时序分析进一步验证了这一发育轨迹。

图3 睾丸生殖细胞的发育轨迹（图片引自文献[1]）

2.揭示细胞发育轨迹

在发育研究中，可以选择自己关注的细胞亚群，通过拟时序分析发现新的发育轨迹。2019年解放军总医院等单位的研究人员在Immunity发表了利用单细胞测序解析人类胚胎胸腺淋巴祖细胞和胸腺器官发生的时空发育文章。该研究通过对胚胎和胎儿时期的早期胸腺祖细胞及胎儿时期肝脏中淋巴祖细胞的Monocle拟时序分析揭示了从胎儿肝脏中的淋巴祖细胞到胸腺中的T淋巴祖细胞的发育路径。

图4 胸腺淋巴祖细胞发育轨迹（图片引自文献[2]）

3.揭示肿瘤免疫细胞动态迁移

在肿瘤或者免疫研究中，可以通过拟时序分析追踪免疫细胞的动态变化及迁移轨迹。2019年北京大学等单位的研究人员在Cell发表利用单细胞测序刻画肝癌免疫细胞图谱的文章，分析了免疫细胞动态迁移和状态转化的特征。该研究鉴定出一群新的树突状细胞DC（传统上分为cDC1和cDC2），即LAMP3+DC。通过RNA 速率分析发现其可能同时起源于cDC1和cDC2。cDC1和cDC2在肿瘤和淋巴结之间并没有明确的定向流动，在LAMP3+DCs中，肿瘤源性细胞显著向淋巴结细胞定向流动。

图5 RNA 速率分析树突状细胞轨迹（图片引自文献[3]）

4.挖掘细胞分化的关键亚群/基因

在分化或发育研究中，可以通过拟时序分析关键的分化节点，挖掘关键的细胞亚群或基因。2018年北京大学等单位的研究人员在Cell Stem Cell发表了利用单细胞测序深入研究小分子化合物诱导体细胞重编程过程的研究。该研究对小分子诱导体细胞重编程过程中的12个时间点的样本进行Monocle拟时序分析发现，重编程过程最终分化为2个分支，一支成功分化为多能干细胞，另一支分化失败。对分支点的关键细胞亚群Ci2C-like进行分子诱导，有效地促进了Ci2C-like相关基因的激活，使化学重编程的诱导周期从40天缩短至16天。

图6 体细胞重编程多能干细胞分化轨迹（图片引自文献[4]）

对于不同的轨迹分析算法，拟时序分析需要研究人员根据潜在细胞分化轨迹及关键基因的表达，确认细胞分化的起点和终点。RNA速率分析直接提供了细胞轨迹分析的起止点，可以对未知分化关系的细胞进行分析。研究人员可以直接选择具有潜在分化关系的亚群或者自己关注的细胞亚群进行拟时序分析。而对于不确定分化关系的细胞，研究人员可以通过RNA速率分析对所有细胞进行分析，筛选出存在分化关系的亚群，进一步进行拟时序分析，挖掘分化轨迹的关键亚群和基因。

参考文献：

1. Guo J, Nie X, Giebler M, et al. The Dynamic Transcriptional Cell Atlas of Testis Development during Human Puberty[J]. Cell stem cell, 2020, 26(2).

2. Zeng Y, Liu C, Gong Y, et al. Single-Cell RNA Sequencing Resolves Spatiotemporal Development of Pre-thymic Lymphoid Progenitors and Thymus Organogenesis in Human Embryos[J]. Immunity, 2019, 51(5):930-948.e6.

3. Zhang Q, He Y, Luo N, et al. Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma[J]. Cell, 2019, 179(4):829-845.e20.

4. Zhao T, Fu Y, Zhu J, et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Dynamic Early Embryonic-like Programs during Chemical Reprogramming[J]. Cell Stem Cell, 2018, 23:31-45.e7.