2020-11-24: 文献阅读: 压力超负荷驱动的心衰小鼠免疫
论文信息
Title: Single-Cell Sequencing of Mouse Heart Immune Infiltrate in Pressure Overload-Driven Heart Failure Reveals Extent of Immune Activation
Journal: Circulation
IF: 23.603
Publish date: 2019
Author: Martini, Elisa; Kunderfranco, Paolo
研究背景
炎症是心脏疾病的临床反应的重要组成之一,巨噬细胞和T淋巴细胞在心力衰竭的过程中发挥重要的作用。因此,通过调节免疫反应进而治疗心脏疾病成为了可能,但是心脏免疫细胞的活性却知之甚少,并且在压力超负载驱动下,心脏免疫细胞是如何变化的也是未知。
技术路线
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Pressure-overload transverse aortic constriction(TAC)的C57BL/6J小鼠模型,分别收集1和4周的TAC和Sham模型的CD45+(infiltration of immune cells)细胞用于单细胞转录组测序;
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快速分离制备心脏CD45+的protocol以及设置duplicates增强分析可靠性;
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Seurat的graph based clustering算法聚类;
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Pearson correlation analysis分析聚类效果;
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使用immune cell gene marker注释scRNA-seq的CD45+ cells;
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堆积图展示免疫细胞簇丰度的ratio信息;
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fluorescence- activated cell sorting(FACS,荧光激活细胞分选办法)验证细胞簇biomarker;
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DESeq2识别差异基因;
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GSVA分析获取不同免疫细胞簇的pathway富集分数。
研究结果
- 心脏组织拥有20类免疫细胞簇,这些细胞簇与疾病发展有密切相关关系。其中丰度前三的细胞群是macrophages/monocytes、B cells和Nature Killer cells。堆积图显示,免疫细胞簇的丰度随着疾病发展发生了变化,这说明心脏毒性免疫反应和多种免疫细胞相关,最后在整体上表现出炎症反应。
- 根据CCR2的出现+或缺失-定义心脏巨噬细胞,定居()和游走()macrophage/monocytes。前者负责清除细菌及外来异物,后者负责招募促炎(proinflammatory)的macrophage/monocytes。Cluster 3富集,而Cluster 4 5 8则富集。进一步分析发现,cluster 3还特异表达与免疫相关的Cd163和Mrc1主要组织相容复合体II(major histocompatibility complex: MHC)。另外,cluster 4和8可能是骨髓来源的macrophage/monocytes,它们表达了促炎症因子oncostatin M (Osm),该基因的过表达促进心脏器官功能障碍。
- Sham和TAC组心脏均有大量B cells,根据四组B cells簇在疾病前后的丰度变化,发现cluster 2 11收到压力后激活。
- 和(更重要)T细胞均在心衰心脏组织出现,flow cytometry验证了两类T细胞的整体丰度类似。unsupervised Reactome signature analysis 揭示 cluster 13 15与T cell receptor signaling pathways显著相关。
- 整合所有免疫细胞的全局分析揭示 TAC和Sham的差异基因表达在疾病发展过程也是动态变化的,第一周和第四周 ll1b等促炎因子基因显著富集在疾病组,在第四周则出现了Ccr2和Cd68等新的促炎因子基因。最后在综合所有TAC和Sham分析,仍然发现类似的现象。
学习心得
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单细胞注释:准确地注释cell type对后续分析至关重要,文章结合marker gene 和簇相关对簇注释和合并;
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簇内进行子分类,每个分类的功能以及marker gene可以进一步解析;功能注释文章用到了unsupervised Reactome signature analysis;
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纵向数据可通过整体簇丰度变化阐明处理对基因的影响;
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GSVA方法对功能富集分析有较大的帮助;
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生物学知识要相当丰富,文章针对是心衰的免疫解析,各类免疫细胞的属性要有详细的了解。TAC后 nature killer cell会增多。
问题和改进
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堆积图面积的变化能够真正说明免疫细胞丰度发生显著变化呢,并且这种变化是否具有临床学的意义呢?文章使用了drastic changes是否合适?
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文章提供的数据存在不严谨标记,TAC 1和4周应该是不同的样本,但它给出的标签是repA 和repB;
Citations
- Martini, Elisa, et al. "Single-Cell Sequencing of Mouse Heart Immune Infiltrate in Pressure Overload–Driven Heart Failure Reveals Extent of Immune Activation." Circulation 140.25 (2019): 2089-2107.