背景

FFPE 样本是目前NGS 主要使用的一类样本。此类样本，经采样后由福尔马林（主要成份 甲醛）固定，可以有效保持细胞组织形态，方便组织样本的保存，供后续研究。

但是，FFPE 样本用于NGS 检测肿瘤特有突变，确存在一些挑战。 主要是，经过福尔马林处理之后，细胞中的DNA 会发生破裂，损伤，交联，造成测序结果的假阳性较多。

具体结论

• FFPE 样本，随着保存时间的增加和缓冲溶液的PH降低，DNA的破碎情况会加剧；破碎的DNA 会引起PCR 富集可用的模板变少，PCR效率变低。可扩增模板数量是能够可靠检测突变的重要指标，一方面低模板数量会引起夹阴性结果，另一方面，低拷贝数会富集DNA损伤带来的假突变。
• 福尔马林会引起碱基脱嘌呤，从而破坏DNA 双链的稳定性。单链DNA的脱嘌呤的概率是双链的4倍，处在片段末端的碱基更易脱嘌呤。福尔马林使得，DNA 变性成单链，更易受损伤。DNA 聚合酶在通过脱嘌呤的碱基位点时，会降低效率，同时引入错误。一般，会由一个新的腺嘌呤进行匹配，有时也可能是鸟嘌呤或者短的几个碱基的缺失。所以会带来假突变。
• FFPE 中最主要的假突变来源是胞嘧啶脱氨基，引起C:G>T:A的突变（富集前用UDG处理可以显著减少影响）。CpG 中的 C 经常被甲基化，甲基化的C 在双链DNA中的脱氨基概率是平常的2倍。所以这类假突变会集中在CpG。
• 序列错误引入的假突变的丰度要超过测序背景噪音，大致在1%左右。所以在低肿瘤纯度或者肿瘤异质性性下，难以区分出这些假突变。目前，可以通过UMI 双链测序，因为损伤一般只会出现在一条链上，所以构建DCS 时可以识别出来。