体外转录法制备dsRNA

该方案是简单而且得到广泛应用的、利用PCR 模板制备双链RNA 的体外转录反应。该方法制备的dsRNA 可以用于在某些细胞或者组织中诱发RNA 干扰。

试剂

琼脂糖凝胶( 1 %)

复性缓冲液( 10 X)

ATP 、CTP 、GTP 、UTP （ 每种100mmol/L )

二硫苏糖醇( DTT ) ( 1mol/L)

DNA 分子质量标准

dNTP 混合液，每种10mmol/L

乙醇( 100％和70%)

Ficoll-Orange G 上样缓冲液( 6 X)

非变性凝胶上样缓冲液( 10 X)

无核酸酶水

寡核昔酸引物

PCR 缓冲液( 10 X)

酚： 氯仿( 1 : 1,VIV)

无RNA 酶的胰腺DNA 酶Ⅰ ( 2U/μL)

乙酸钠( 3mol/L , pH 5.2 )

SYBR Gold ( 10000 X) 或者溴化乙锭（10mg/mL)

T7RNA 聚合酶( 20U/ μL)

T7 转录缓冲液（10 X)

TAE 缓冲液( 50 X , 1 X)

Taq DNA 聚合酶( 2.5U/μL)

TBE 缓冲液( 5 X , 0.5 X)

PCR 用DNA 模板

设备

琼脂糖凝胶电泳仪

离心机

微量离心管(1.5m.L)

PCR 管(0.5mL, 薄壁）

Primer3 软件

分光光度计

热循环仪

涡旋振荡器

方法

制备体外转录用DNA 模板

1 在有关的数据库或者根据序列数据，分析目的基因的mRNA 、cDNA 或者基因组序列。

2 选择长度为500~800bp 的靶区域作为dsRNA 模板。

3 利用BLASTn 有义链和反义链进行同源性分析。如果某条链与非目的靶基因同源，则重复步骤2 。

4. 用Primer3 软件设计长度为20 ~ 24 个核昔酸的正向和反向引物，使其Tm值约为60°C（http://primer3.sourceforge.net/) 。

5. 将T7 启动子序列( 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′) 加到两条引物的5’端。需要准备带有或者不带有T7 启动子序列的正向和反向引物（两对引物） 。

6 分别进行两套PCR 反应，生成RNA 有义链和反义链所使用的DNA 模板。每生成一个DNA 模板，需要将下列试剂在 1.5mL 试管中配制成一个500μL 的PCR 体系：

a 用作PCR 的模板，使用0.05 ~100ng 克隆的质粒或噬菌体DNA , 0. 5~ 5μg 基因组DNA, 或者10~20μL 反转录反应生成的cDNA 。

7 轻微混合，涡璇离心1 ~ 2s 将试剂甩至试管底部，然后将其分装到为0.5mL 薄壁PCR管中，每份100μL 。

8 将试管放入热循环仪中，按下列程序进行25 个扩增循环：

i. 94 ℃    2min

ii. 94℃    45s

iii. 50℃   45s

iv. 72℃   60s

v 再次重复ii~iv, 24 个循环。

vi. 72 °C  5min

vii. 4 °C   保存

viii. 结束

9 同时，用TAE 缓冲液制备一块1 ％的琼脂糖凝胶 。

10. PCR 反应结束后，将5μLPCR 产物与1μL 6X Ficoll Orange G 上样缓冲液混合后上样通过电泳分析PCR 产物。Orange G 染料位于电泳的前沿而不会在电泳时遮盖任何条带。

11. 将步骤10 剩余的DNA 扩增产物转移至一个新的1.5mL 微量离心管中，加入1/10体积的乙酸钠（3mo l/L, pH 5.2) 和2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在－20°C 或者更低的温度下放置30min 以上，使PCR 产物沉淀。4°C 最大转速离心30min, 弃去上清。

12. 用1mL 70％乙醇洗沉淀以去除残留的盐类。4 °C 最大转速离心5min, 最大可能地弃去上清(70％乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。

13. 将DNA 沉淀溶解于50μL 水。

制备dsRNA

14. 将T7RNA 聚合酶置于冰上放置，其他试剂室温放置。室温下，按下列配方在1.5mL微量离心管中配制一个100μL 的体外转录体系：

如果实验需要更多的RNA, 等比例扩大反应体系。

15 轻轻涡旋1 ~ 2s 使试剂离心至试管底部。

16 37°C 孵育2h 。

17 加入5μL （ 10U) 无RNA 酶的胰腺DNA 酶I (RNase-free pancreatic DNase I) 。

18 轻轻涡旋1 ~ 2s 使试剂甩至试管底部。

19  37°C 孵育30min 。

20 加入等体积的酚：氯仿( 1 : 1,VIV) ，涡旋20s 。4°C 最大转速离心15min, 分离固相、液相，将液相层转移至一个新的1.5mL 微量离心管中。

21 向液相中加入1/10 体积的乙酸钠( 3mol/L ， pH 5.2) 和2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在－20°C 或者更低的温度下放置30min 以上，使PCR 产物沉淀。4°C 最大转速离心30min 。

22 弃去上清。加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐类。4 °C 最大转速离心5min 使RNA 沉淀，最大限度地弃去上清(70％乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。

23 将RNA 沉淀溶解于100 μL 的无核酸酶水中。利用吸收光分光光度计测量RNA 的浓度。

24 使两条链复性， 生成0.5μmol/L 的dsRNA 溶液：

检查dsRNA 的完整性

28 用0.5 X TBE 缓冲液配制一块1％的琼脂糖凝胶。

29 将dsRNA （步骤27 中得到的）和ssRNA （步骤23 中得到的有义链和反义链，作为对照使用）溶解于1 X 非变性凝胶上样缓冲液中，终浓度为0.1 μg/μL 。

30 每个样品上样5μL, 在0.5 X TBE 缓冲液中进行电泳，恒压75V 。

31 电泳结束后， 室温下用SYBR Gold ( 1 : 10000 溶解于0.5 X TBE 缓冲液） 或者溴化乙锭( 1 : 20000 溶解于0.5 X TBE 缓冲液）染色10 min, 在紫外光下观察RNA 条带。

疑难解答

问题（步骤23) ： 没有检测到转录产物。

解决方案： 更换连接到引物上的T7 启动子（步骤5 ) 。

检查体外转录使用的试剂（步骤14 ) ； 确认所有的试剂都已添加，并且T7 聚合酶有活性。使用新鲜的NTP 和DTT 进行体外转录反应。

问题（步骤31) ： 发现污染条带或与PCR 产物（步骤10 ) 同样大小的条带。

解决方案： 凝胶中有污染条带表明由于RNA 酶的污染导致RNA 降解。要求实验全程都要戴手套，并且要经常更换。使用无RNA 酶的试剂、试管和移液器吸头。使用RNA 凝胶电泳专用的TBE 缓冲液和电泳装置。与PCR 产物（步骤10 ) 同样大小的条带表明DNA酶Ⅰ 失活。对于仍然含有带有模板DNA （步骤23 中） 的体外转录RNA （步骤16 ) 或纯化后的RNA 要用不同批次DNA 酶Ⅰ（来自步骤17 ～ 步骤19 ) 处理，并重复纯化和复性过程（步骤20 ～步骤27 ) ，然后再进行电泳检测dsRNA （步骤28～步骤31 ) 。