本期解读文献内容“ LncRNA依赖的雄激素受体调控基因表达的机制研究 ”

一、调控通路

实验调控通路图

DHT刺激细胞后，雄激素受体（AR）C-端与LncRNA PRNCR1结合，联合另一个LncRNA PCGEM1招募DOT1L将AR的A-端甲基化；
LncRNA PCGEM1同时与PYGO2结合，然后LncRNA将AR和PYGO2结合到靶标基因的增强子区促进基因的表达。

二、实验流程

实验步骤

作者首先用AR抗体进行RIP实验获得了与AR结合的LncRNA PRNCR1和PCGEM1，又通过ChIRP实验验证了AR与LncRNA PCGEM1以及基因组蛋白的关系，RNA pull-down验证LncRNA PRNCR1和PCGEM1结合AR；随后作者通过一系列的RNA pull-down实验验证LncRNA PCGEM1与AR、PYGO2、DOT1L的互作关系；为了说明LncRNA PRNCR1和PCGEM1参与基因的转录过程，作者对LncRNA进行敲低后检测靶标基因Mrna的表达；为了检测AR与LncRNA的结合位点，作者使用RIP实验进行验证；最后作者通过一系列的ChIP实验验证LncRNA、AR、PYGO2与靶基因启动子、增强子的互作，作者对LncRNA敲低后细胞进行ChIP实验说明PYGO2的靶基因的作用是由LncRNA介导的。

三、核心FIGURE

image image

Figure1说明的是前列腺癌细胞特异LncRNA与雄激素受体（AR）的相互作用。

a-b、RIP实验，用AR抗体钓取前列腺癌细胞和普通畸形前列腺增生细胞中AR结合的RNA，然后进行Q-PCR检测，表明前列腺癌细胞的lncRNA PCNCR1和PCGEM1高度结合。

c、RIP实验，用AR抗体钓取经二氢睾酮处理后细胞中与AR结合的RNA，结果表明二氢睾酮诱导AR结合lncRNA PCNCR1和PCGEM1。

d、RIP实验，用AR分别钓取PCNCR1敲低，PCGEM1敲低细胞中结合的RNA，结果表明PCNCR1敲低后两种LncRNA与AR结合均下降，而PCGEM1敲低后，PCNCR1与AR的结合不受影响。

e、ChIRP实验，细胞经DHT处理后，用PCGEM1探针钓取与之结合的核酸和蛋白。

image image

Figure2说明的是LncRNA与转录因子/共激活物的互作。

a-b、RIP，对AR进行突变，然后用Flag标签抗体钓取经二氢睾酮处理后与AR结合的RNA，结果表明AR的K631/634Q突变后，LncRNA结合明显增强，说明AR K631/634的乙酰化使LncRNA与AR相互作用增强。K349R突变后，PCGEM1结合降低表明AR结合PCGEM1需要K349的甲基化。

c、AR的体外甲基化实验，DOT1L使AR甲基化。

d、RNA pull-down，将AR分为不同片段连接到表达载体上转染细胞，然后用PRNCR1探针做Pull down，结果表明PRNCR1结合AR的区段为549-623位氨基酸之间。

e、RNA pull-down，将AR分为不同片段连接到表达载体上，与DOT1L表达载体共同转染细胞，然后用PCGEM1探针做Pull down，结果表明在AR的K349甲基化后PCGEM1与AR的N-段结合。

f、RNA pull-down，用PCGEM1全长和截短探针钓取与之结合的蛋白，然后用WB检测AR和PYGO2，表明PCGEM1结合AR的区段为411-490，结合PYGO2区段在1191-1270。

image

Figure3说明的是Lnc促使PRGO2和AR结合到靶标基因的增强子区促进基因表达。

A、q-pcr检测AR表达，LncRNA敲低细胞的PSA等基因的表达，表明AR的表达促进靶标基因的表达，而LncRNA敲低后靶标基因的表达下降。

B、CHIP-3C，表明PSA基因结合AR的区域。

C-D、CHIP，用PYGO2抗体钓取经HDT处理的细胞与PYGO2结合的DNA片段，然后进行Q-PCR验证，表明HDT处理后PYGO2结合到PSA基因的增强子区和启动子区。

E、CHIP-3C，表明PYGO2敲低后，结合的PSA增强子减少。

F、CHIP，LncRNA敲低后，用AR抗体钓取与蛋白结合的DNA片段然后继续Q-PCR检测，表明LncRNA敲低后AR结合靶标基因减少。

参考文献：Liuqing Yang, Chunru Lin, Chunyu Jin,et al.lncRNA-dependent mechanisms of androgenreceptor-regulated gene activationprograms［J］.Nature,2013,500(7464): 598–602