重组DNA分子的构建
重组DNA分子的构建
【实验目的】
熟悉DNA的酶切、片段回收、DNA连接、转化以及重组子的筛选的方法。
【实验原理】 DNA经限制性内切酶切割成大小不同的片段，电泳分离后，切胶回收目的片段，琼脂糖凝胶用高浓度的NaI溶液溶解后，玻璃奶（glass milk）可以吸附DNA，去除NaI后，用无菌水或TE缓冲溶液解吸附，获得DNA-片段。回收的酶切质粒DNA与目的DNA-片段，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，构建重组子，重组子转化大肠杆菌后，提取重组DNA分子进行酶切鉴定或利用其它方法如α-互补进行筛选。
【器材与试剂】
1．实验仪器 细菌培养箱，恒温摇床，超净工作台，台式离心机，水浴锅，高压灭菌锅，微量移液器，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)2．实验试剂 氯化钠（AR），蛋白胨，酵母提取物，氨苄青霉素钠，EcoR I, Hind III, 酶切缓冲液（买酶附赠），琼脂糖，TAE缓冲溶液（50×），玻璃奶（glass milk）， NaI溶液（溶胶液）： 称取NaI 90.8 g, Na2SO3 1.5 g，用无菌水溶解并定容至100 mL，4℃，避光保存；乙醇洗涤液：50 mL乙醇中含 20 mmol/L Tris-Cl (pH7.4), 1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl, -20℃保存；灭菌双蒸水，T4 DNA连接酶，T4 DNA连接酶缓冲液（购酶附赠），载样缓冲溶液（10×），X-gal溶液：20 mg 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal） 溶于1 mL二甲基甲酰胺中；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶液：1 g IPTG 溶于4 mL双蒸水，定容至5 mL，微孔滤器除菌，-20℃保存。
3．实验材料 E.coli DH5α, pUC18质粒，λDNA/EcoR I, Hind III。
【实验步骤】
一、DNA的酶切
20 μL酶切体系含：2 μL 酶切缓冲液，5 μL pUC18质粒（ 约2μg），1 μL EcoR I ，1 μL Hind III, 11 μL 无菌双蒸水。离心5 s, 混匀，37℃酶切30 min～1 h。
二、电泳分离
1． 配制1%的琼脂糖凝胶，方法同前一实验。
- 20 μLλDNA/EcoR I, Hind III（约2 μg）和酶切体系中分别加入2 μL载样缓冲溶液（10×），混匀，分别加样，电泳，具体方法如前一实验。
3． 将凝胶在溴化乙锭染色液中染色30 min。
三、DNA回收
1．在紫外灯下将含线性pUC18质粒DNA和947 bp λDNA-片段的凝胶分别切下置1.5 mL Eppendorf管中, 加入3倍于凝胶体积的NaI溶液溶解，50℃水浴溶胶，间或摇动，至凝胶完全溶解。
2．加入10 μL玻璃奶，混匀，室温放置5 min，8000 rpm离心1 min，弃上清。
3．沉淀用0.2 mL 的乙醇洗涤液悬浮，8000 rpm离心1 min，弃上清。
4．重复操作3 - 将Eppendorf管开口于室温放置至玻璃粉变白，加入20 μL 无菌双蒸水悬浮，50℃水浴保温5 min。
- 10 000 rpm离心5 min，分别取出上清置于一Eppendorf管。
四、DNA 连接
1．20 μL连接体系含：7 μL回收的pUC18质粒DNA，10 μL回收的λDNA-片段，2 μL T4 DNA连接酶缓冲液，1 μL T4 DNA连接酶。
1． 12～16℃条件下，连接过夜。
五、转化
１．配制LB液体和固体培养基，方法同前。制备含100 μg/mL氨苄青霉素钠的LB培养基固体平板，将20 μL X-gal 和4 μL IPTG均匀涂布在每一平板表面，37℃，放置1 h。
２. 取10 μL连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，取200 μL转化产物涂布在平板上，37℃培养过夜，观察菌落数量和颜色。
【注意事项】
1． 溶胶的时候，一定要使凝胶溶解彻底，以免连接产物在12～16℃条件下重新凝固。
2． 操作过程中乙醇洗涤液一定要挥发干净，否则影响随后的连接反应。
