CD3ε区域改造减少多反应性
Adimab 公司对抗CD3ε 抗体进行了有益改造，这是一篇工作非常完整的基于结构的抗体工程文章。
1 摘要
双抗是治疗性抗体快速增长的领域，大约三分之一临床中的分子都是含有 anti-CD3 结合臂的 T 细胞连接子。CD3 抗体与食蟹猴有交叉反应性，能识别CD3ε N端的高电负性的线性表位。这些抗体具有高等电点，并且具有多反应性的问题（与单特异性抗体较差的药代动力学相关）。利用 anti-Hu/Cy CD3 抗体 ADI-26906 与 CD3ε 的复合结晶结构，文章使用 yeast-based 抗体工程方法开发了高亲和力的 CD3 抗体突变体，同时具有较低的多反应性和显著提升的成药性。通过对比临床中的CD3抗体发现，CD3的亲和力与多反应性具有相关性。文章工程化改造的CD3抗体打破了这种相关性，形成了具有广泛亲和力并且具有较低或者没有多反应性的组合。这些抗体有助于提升双抗的药代动力学和安全性，也有助于使用工程化的方法提升 T 细胞连接子的更广范围的应用。
2 引言
1、T 细胞是通过 TCR-CD3 复合物进行激活的，CD3 作为信号转导的组分，需要进行交联来促进 T 细胞的激活。激活会导致T细胞表面早期 makers CD69 和 CD25 转录上调。这些 markers 会调节 T 细胞增殖反应的强度。激活反应也会引起 T 细胞释放促炎性细胞因子，例如 IL-2, IFNγ，TNFα/β 和 其他一些 Th1 细胞。越来越多的文献表明，靶向 CD3 的双特异性抗体模拟了基于 TCR/ pMHC 介导的免疫突触形成机制的动力学分离机制。
2、对于一个具有治疗性双特异性抗体，它必须同时具有连接效应细胞和目标细胞，进行杀伤，并且具有良好药代动力学特征。针对抗体在临床前开发过程中的成药性问题，已经开发了多种评估方法。这些方法包括杆状病毒颗粒（BVP）和多特异性配体（PSR）结合以及肝素硫酸盐色谱，用于评估 非特异性结合，以及亲和力捕获自相互作用纳米粒子光谱（AC-SINS），用于测量 抗体自相互作用 倾向。这些检测方法与成药性的关系可参考上一篇介绍 抗体药物成药性信息汇总
3、“polyreactivity” 是指抗体能够以弱亲和力非特异性地与许多不相关的蛋白质和脂质结合的能力。这些“粘性” 相互作用被认为是由抗体 Fv 包含过量电荷或者疏水物质所致。
4、研究表明，几种 T 细胞接合双特异性抗体的一种趋势是，亲和力较强的 CD3 抗体与较短的血清半衰期相关，而且较强 CD3 的亲和力会影响抗体的效力和毒性，例如会导致细胞因子释放综合征 (CRS) 。 文章认为 CD3 亲和力与许多不利特性之间的关系源于 CD3 与抗体的定向结合机制。目前临床中 CD3 双特异性抗体，大多数含有抗 CD3 序列，这些序列是 SP34 的衍生物(SP34 是一种食蟹猴 cyno 交叉反应谱系，已知其靶向 CD3ε 的 N 端，而 CD3ε 是一个高电负性区域，含有酸性氨基酸）。由于识别 CD3ε N 端的高亲和力 CD3 抗体含有较多的的 Arg 残基，两者之间可能存在静电相互作用。抗CD3的抗体 Fv 可能存在较高的等电点 (pI) 。根据 Shehata 等人的研究，pI ≥9.3 的单克隆抗体 (mAb) 更有可能具有多反应性。文章假设静电结合机制是导致 CD3 的亲和力与猕猴交叉反应谱系中多反应性升高存在相关性的原因。
3 结果
3.1 与 CD3 结合的临床试验抗体的多反应性与亲和力呈正相关
1、为了研究 CD3 结合与成药性之间的相关性，文章首先评估了新开发的 CD3 谱系和截止2020年6月已经临床批准的 27 种含抗 CD3 抗体的Fv。为了方便不同类型的抗体相互比较，将具有抗 CD3 的可变区同一表达为人 IgG1 类型。使用 PSR 结合分数测量非特异性结合，使用 AC-SINS 评估自身相互作用倾向。Table S1 列出了汇总的 27 种 CD3 抗体的序列信息。
2、对于文章新开发的 CD3 谱系，升高的 PSR 评分和 AC-SINS 最大波长偏移与对 人 CD3εδ 的单价亲和力呈正相关（见Fig1ab，
3、在整个临床组中，猕猴交叉反应性抗 CD3 抗体的平均 PSR 和 AC-SINS 值分别为 0.57 和 19.9，而对于人类 CD3 特异性结合剂，PSR 和 AC-SINS 的平均值分别为 0.26 和 9.56（见Fig1ef）。测试的猕猴交叉反应性 CD3 抗体的 PSR 和 AC-SINS 评分明显高于人类特异性 CD3 抗体（分别为 p = 0.0062 和 0.0236）。该结果与文章的假设一致，即静电相互作用是造成猕猴交叉反应性抗体对 CD3ε 的亲和力与多反应性升高之间相关性的原因，因为大多数这些谱系识别的共同表位具有高度电负性。
4、之前一项研究表明 Fvs 区具有较高理论等电点（pI > 9.3）的抗体比较低等电点的抗体具有更差的成药性。为了验证该结论，文章比较了 137 个临床抗体理论 Fv pIs 和对应的多反应性数据。结果显示，pI > 9.3的组和 pI < 9.3 的组，PSR值存在显著差异（见Fig1g）。文章也比较了3个不同抗CD3抗体组的 pI 值，猕猴交叉反应性 CD3 抗体 Fvs 含有更高的等电点（见Fig1h）。
5、文章测量了12个新开发的 CD3 谱系Fabs 与人CD3εδ 的亲和力，结果显示具有更高亲和力的抗体（Kd≤10nM）具有更高的 pI 值。也印证了之前的假设，电荷间的相互作用会影响多反应性和亲和力（见Fig1S）。
3.2 ADI-26906 与 CD3ε N13 肽结合的整体结构
1、为了深入了解 CD3 抗体谱系的结构，文章解析了 ADI-26906 Fab 与人类 CD3ε N 端 13 个残基肽的复合体晶体结构（PDB ID: 8F0L）。ADI-26906 是新的 CD3 谱系的高亲和力抗体 ( KD = 1.1 × 10 M)，也是大多数谱系成员的亲本序列。
2、CD3ε 的极端 N 端是有序的，形成典型的 3螺旋（DGNEE 残基），位于 ADI-26906 结合位点的凹面互补位点（见Fig2ab）。
3、为了验证 ADI-26906 和 N13 肽之间重要的静电相互作用，文章使用 PYMOL 和 APBS 生成了 pH 7.0 下配体和互补位的静电表面电位图。发现配体表面的解析部分具有高度电负性。ADI-26906 互补位在互补位 - 配体界面处包含带正电的斑块，而 Fv 非互补位区域的表面则带较少的正电（见Fig2d）。
3.3 ADI-26906 与 CD3ε 相互作用的结构决定因素
1、N13 肽的第一个残基为焦谷氨酸 (pGlu1)，它在 ADI-26906:CD3ε 结合中起着至关重要的作用。pGlu1 深埋在互补位中心的口袋内，与 H3-Tyr100 和 H1-Tyr33 进行疏水接触。在其结合口袋的另一侧，pGlu1 通过与 L3-Arg96、H1-His35 和 H3-Asp95 形成氢键而稳定下来（见Fig2e）。
2、CD3ε N13 残基 Glu6 在与 ADI-26906 结合中也起着重要作用。Glu6 是一种酸性氨基酸，它与 L1-Lys30 形成盐桥，将其固定在该结合口袋中。Glu6 与其接触残基 L1-Thr30、L1-Lys30和 L1-Tyr32之间的氢键网络似乎增强了整体结合相互作用（见Fig2f）。
3、除了形状互补和疏水接触外，结合相互作用还受到静电的强烈驱动。如上所述，在这个静电界面上形成了三个关键的盐桥：肽上的 Asp2 与 L3-Arg94 和 L3-Arg96 形成盐桥，Glu6 与 L1-Lys30 形成盐桥。由于 CD3ε N13 肽 (GGITQT) 的六个 C 端残基在结构中未解析，并且可能与 ADI-26906 没有明显接触，这表明 CD3ɛ 的前七个残基 (QDGNEEM) 足以相互作用。由于已公布的猕猴 CD3ɛ N 端序列与人类在此区域相同，文章的结构证实了这种共享的氨基酸序列是 ADI-26906 与猕猴交叉反应的基础。
3.4 基于结构的降低新型 CD3 谱系多反应性的原理
1、根据 ADI-26906:CD3ε 界面结构，对 ADI-26906 适合位点进行突变而不破坏与CD3ε 结合。为了抵消带正电荷的结合表面并降低整体抗体 Fv pI，文章在 ADI-26906 的 CDR 中引入了酸性氨基酸。
2、具体而言，选择远离抗原结合界面且溶剂暴露的位置。CDR H2 是三个候选 CDR 中最长的，有 17 个残基。它的 SASA 占 ADI-26906 中所有 CDR 总 SASA 的近四分之一。文章预测 H2 沿线应该有许多位置可以作为有益的替换位点。文章对 ADI-26906 重链或轻链的 CDR 进行一、二或三个酸性氨基酸替换。
3.5 单一的天冬氨酸和谷氨酸替代验证了结构发现
1、文章利用单酸性氨基酸置换库和丙氨酸突变进一步验证了ADI-26906:CD3ε 界面结构的氨基酸残基的相互作用关系。总体而言，细胞染色流式 结果和生物层干涉法 (BLI) 结合结果与结构发现一致（见Fig3a-c，y轴左代表荧光强度，y轴右代表亲和力）。
3.6 酸性氨基酸取代成功降低了 ADI-26906 和高亲和力变体 ADI-50024 中的多反应性
1、文章进行了三轮筛选，以筛选保持 CD3 亲和力且多反应性降低的抗体。在第一轮中，将文库与 100 nM CD3εδ 异二聚体一起孵育，将与亲本 ADI-26906 结合力相当的克隆进行筛选。第二轮中，对不结合 PSR 的克隆进行筛选。在第三轮中，以一系列 CD3ε N13 肽浓度（1、10、100 nM）标记第二轮输出，并分选出结合力等于或优于 ADI-26906 的克隆（见FigS3）。最终筛选了13个有备选的克隆。
2、文章重复检测了这 13 个克隆的性质，与 ADI-26906 相比，这些抗体的 PSR 和 AC-SINS 分数大大降低，而 CD3εδ 亲和力的降低有限（见Fig4ab）。
3、通过结构引导和酸性氨基酸替代文库和选择方法，文章设计了与原始抗 CD3 抗体谱系亲和力相近的抗体，但多反应性特性显著降低。
4 参考文献
[1] Liu CY, Ahonen CL, Brown ME, Zhou L, Welin M, Krauland EM, Pejchal R, Widboom PF, Battles MB. Structure-based engineering of a novel CD3ε-targeting antibody for reduced polyreactivity. MAbs. 2023 Jan-Dec;15(1):2189974. doi: 10.1080/19420862.2023.2189974. PMID: 36991534; PMCID: PMC10072072.
