生信分析：Nature biotechnology前沿：近细胞水

有粉丝在后台留言想了解空间转录组，那么今天就给大家分享一篇发表在Nature biotechnology（IF：36.558）关于空间转录组测序的工具文章。

空间转录组：在多细胞生物中，单个细胞的基因表达严格按特定的时间和空间顺序发生，即基因表达具有时间特异性和空间特异性。空间转录组是从空间层面上解析RNA-seq数据的技术，定位和区分基因在特定组织区域内的活跃表达。

基于 Slide-seqV2的高灵敏度近单细胞精度的空间转录组学

单细胞空间转录组非常火，但目前的单细胞空间转录组由于技术原因的限制还是没有能做到真正的单个细胞精度。今天要重点介绍一下 Slide-seqV2这种新技术，它基于Slide-seq，并在文库生成、 bead合成和阵列索引上有所改进。使 RNA 捕获效率达到单细胞 RNA seq 数据的50% (比 Slide-seq 数据高10倍)。作者通过识别小鼠海马神经元树突状定位的 mRNA来检测Slide-seqV2的高捕获效率。此外，作者还综合了 Slide-seqV2数据的空间信息和单细胞轨迹分析工具来描述小鼠新皮层的时空发展特征。

1 Slide-seqV2原理简介

首先要明确一点， Slide-seqV2是基于 Slide-seq的深入优化，二者大致的化学原理非常相似，所以我们需要先弄明白 Slide-seq是如何工作的。

Slide-seq首先将独特的 DNA-barcoded 10μm 微粒(“ beads”，类似于 Drop-seq 单细胞 RNA 测序方法中使用的那些微粒)放在一个橡胶涂层的玻璃罩上形成一个单层，称之为“ puck”。每个珠子的不同条形码序列可以通过 SOLiD (寡核苷酸连接测序与检测)来确定。然后，通过冰冻切片将10μm 新鲜冷冻组织切片转移到干燥珠表面，从组织中释放的 mRNA 被捕获到珠子上用于制备3′端条形码 RNA-seq 文库。

现在我们来看看Slide-seq是如何改进的。首先，作者提出了一种新的策略，使用单碱基编码方案对条形码珠阵列进行空间索引，并使用偏移引物的顺序询问进行连接测序。这样做的可以避免之前双碱基编码的两个问题，第一是SOLiD双碱基编码在商业化上缺乏可行性，第二是双碱基序列条码和 Illumina 测序之间的计算匹配需要色彩空间和基准空间之间的转换，并且不具有错误鲁棒性。而现在使用的单测序策略( monobase-sequencing strategy)，只使用现成的试剂，就相当于执行数组索引中的 SOLiD。外，作者还优化了10μm 聚苯乙烯条形码珠子的裂池合成条件 ，提高了条形码的克隆性。此外还包括了逆转录反应上的一些改进。总之，些策略使得每个Illumina read更有效地复原 Slide-seqV2 arrays的基因表达

2 对比

作者将Slide-seqV2与smFISH，scRNA-seq以及Slide-seq第一代做了对比，证明了相比于一代有了较大的提升，并有与scRNA-seq相当的mRNA捕获能力。

此外，作者还与目前最主流的10x 商业化的空间转录组方案Visium 做了对比，发现Slide-seqV2的捕获效率高于最近发布的商业空间转录组学(ST)技术(平均UMI：Slide-seqV2 = 45,772; 10x visgenomics Visium = 27,952），此外，还比较了 Slide-seqV2与另一种空间分辨率高的 ST 技术 HDST 的灵敏度。发现在小鼠嗅球中，Slide-seqV2比 HDST 捕获更多的转录本(平均差44.9倍)。

3 应用

因为更高的捕获灵敏度对一些生物学问题非常重要，接着作者应用 Slide-seqV2技术来研究这类问题。神经元积极地将特定的 mRNAs 运输到树突和突触后，在突触发育和可塑性中发挥关键作用。以往的研究通过物理显微切割或细胞培养来探索树突的富集，但没有一个系统地确定树突状定位的原位转录体的分布。树突状 mRNAs 只是神经元转录中的一小部分，因此需要更高灵敏度的方法来检测它们。为了从小鼠海马 Slide-seqV2数据集中识别树突状定位的 mRNAs，作者利用了 CA1神经肽的定型结构，将转录本的空间定位减少到垂直于 CA1胞体层的一维(1D)剖面(从胞体到锥体层，并穿过放射状层)。对于在 Slide-seqV2中检测到的每个基因，计算了空间表达式与神经元胞体距离的函数关系(图2b 所示的代表性空间表达式图)。

为了筛选树突状定位的 mRNA，随后进行了差异表达分析，比较了近端放射层和胞体。因为CA1神经元包含胶质细胞类型(即小胶质细胞和星形胶质细胞) ，它们也参与 RNA 的分析，因此只包含 CA1锥体细胞表达的基因(CA1锥体细胞大于0.5/100万) 。根据海马的现有 scRNA-seq 数据排除那些非神经元细胞类型的标志物，通过对近端神经肽和胞体的差异表达分析，发现213个显著基因具有高于2倍的树突富集(q < 0.05，非配对 t 检验，)。这些基因与前两个研究发现的树突状富集 RNA重叠显著(p < 10-16) ，提示 Slide-seqV2可以发现真实的树突状富集基因。

4 总结

作者基于 Slide-seq技术的深度优化开发了 Slide-seqV2测序技术，通过与其他类似技术对比证明 Slide-seqV2在mRNA捕获效率上的优势，并在神经生物学等需要高分辨率空间信息的生物学问题上说明了 Slide-seqV2的可靠性和实用性。

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