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10x Genomics PBMC(一):单细胞测序分析 (Ch

2020-06-03  本文已影响0人  程凉皮儿

最近有人问起单细胞测序分析的问题,我确实没有做过,就先来学习一下吧。
先在搜狗微信找到一些介绍引用一下:

单细胞测序有着漫长的过去,却只有短暂的历史—-谁说的!

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说她漫长是因为到如今也有十几年的历史了(汤富酬老师2009年的文章使得单细胞测序成为现实,郭国骥老师2010年的文章揭示对500多细胞进行48个基因的单细胞RT-qPCR就可以进行细胞类型区分,使得单细胞测序方向转向大量细胞低深度测序),说她短暂是因为针对单细胞的分析工具越来越有意义开发周期却越来越短。一般生物信息流程主要由软件(安装与参数)、数据库(结构和生物学意义)和数据分析(统计学和编程)组成,目前单细胞分析用到的软件主要是FastQC、Cellranger和R包Seurat、monocle;数据库有相应物种的参考基因组KEGG、GO;数据分析部分主要基于count矩阵和差异表达数据用R或者Python来做。

在GitHub搜索关键词single-cell-tutorial一共有32条结果:

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排在前面的都是基于python的。
那就先下载2个学习了。
今天先来学习克利夫兰诊所LRI定量健康科学部的一个实验室的教程,是今年1月份上传的,还是比较新的。

10x Genomics 单细胞测序分析 (Chromium)

参考学习资料:
本教程是一个介绍性的单细胞测序数据分析。将用公共数据集涵盖理论和实验。先决条件:笔记本电脑,没有任何其它要求。
https://github.com/hwanglab/singlecell_tutorial/blob/master/01_singlecell_intro/01_intro.html

原作者邮箱hongc2@ccf.org,单位:克利夫兰诊所LRI定量健康科学部

单细胞测序的好处

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图1. 单细胞转录组(sc-RNA-seq)揭示了被常规转录组(bulk RNA-seq)方法掩盖的细胞异质性。

scRNA-seq分析的挑战

尽管scRNA-seq能够捕获细胞水平的表达,但样品制备和文库制备的成本更高,分析也更复杂,更难解释。scRNA-seq数据分析的复杂性包括:

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图2. Wagner, A, et al. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics, Nat Biotechnol. 2016

跨细胞/样本的技术可变性

技术来源的变异可能会导致基于技术来源的细胞之间的基因表达更相似/不同,而不是基于生物细胞类型/状态,这可能会模糊细胞类型的身份。技术差异来源包括:

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图3. Suggested experiments from Hicks SC, et al., bioRxiv (2015)

一定要在您的实验元数据中包含批次信息。在分析过程中,我们可以将由于批次而引起的变化进行回归,这样,如果我们掌握了这些信息,就不会影响我们的结果。

10x Genomics’ scRNA-seq

Gel-in bead(凝胶珠)

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图4. 10x Genomics single cell 3’ gel bead

GEMs油滴

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图5. 10x Genomics Chromium Next GEM Chip G

一个油滴 (GEM)=一个单细胞+一个凝胶微珠=一个scRNA-Seq,可以说这就是10X的基本技术原理。

The number of cells to capture

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图6. 10x Genomics Chromium Next GEM Chip G

Sequencing

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图7. 10x Genomics Chromium Single Cell 3’ Gene Expression Library

本文的3个知识点总结

更详细的背景介绍参考:单细胞测序(scRNA-seq)通关||数据处理必知必会
单细胞实战(五) 理解cellranger count的结果

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