易基因| 植入前胚胎的全基因组DNA甲基化和转录组分析揭示水牛胚

水牛（Bubalus bubalis）是热带和亚热带地区重要的经济动物，但水牛产业的发展受到但其低繁殖力的极大限制。体外胚胎生产（in vitro embryo production，IVEP）和体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）等胚胎生物技术可以加速水牛的遗传育种，并促进水牛产业的发展。然而，低囊胚发育率（26.5%–39.48%）影响了其广泛应用。受精后，受精卵将发生卵裂，其发育将从母体过渡到合子，这一过程称为母源-合子转换（maternal-to-zygotic transition，MZT），与胚胎基因组激活（embryonic genome activation，EGA）相关。植入前胚胎在MZT过程中经历转录和表观遗传重编程高度变化。探索水牛植入前胚胎发育（pre-implantation embryo development，PED）与EGA相关分子机制具有重要意义。但水牛EGA过程中发生的转录和表观遗传复杂调控机制仍不清楚。

2023年7月11日，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室(广西大学) 伏彭辉博士和中国农业科学院深圳农业基因组研究所张杜博士为并列第一作者，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室(广西大学)石德顺教授和中国农业科学院深圳农业基因组研究所高飞研究员为共同通讯作者，在《J Anim Sci Biotechnol》杂志发表题为“Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantation embryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes”的研究论文。该研究通过对水牛的生发泡（germinal vesicle，GV）卵母细胞、中期Ⅱ（metaphase II，MII）卵母细胞以及体外受精（in vitro fertilization，IVF）胚胎的7个关键阶段（受精卵、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑椹胚和囊胚内细胞团(inner cell mass ，ICM)）进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）分析，绘制了水牛植入前胚胎的转录组和DNA甲基化图谱。构建了水牛植入前胚胎发生的完整基因表达时间序列，阐明了水牛MZT过程中的EGA和遗传程序，鉴定了水牛MZT过程中关键的转录特征和表观遗传修饰，并深入了解了与EGA相关的分子机制。

标题：Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantation embryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes（植入前胚胎的全基因组转录组和DNA甲基化动态变化揭示了水牛胚胎基因组激活进展）

发表期刊：Journal of Animal Science and Biotechnology      

发表日期：2023年07月11日    

影响因子：IF 7

技术：单细胞全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）、单细胞转录组测序（scRNA-seq）等

研究摘要

在哺乳动物植入前胚胎发育（PED）过程中，母源-合子转换（MZT）过程通过表观遗传修饰和基因表达来调控，并与胚胎基因组激活（EGA）有关。在MZT期间，胚胎对环境敏感，易在体外停滞。然而，水牛EGA的发生时间和调控机制尚不清楚。

本研究对水牛植入前胚胎进行基于单细胞的RNA-seq和全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），以绘制转录组和DNA甲基化图谱。水牛PED过程中分为四个典型的发育阶段。通过基因表达和DNA甲基化变化综合分析，在16细胞期鉴定出水牛的主要EGA。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）揭示了水牛母源-合子转换过程中的阶段特异性模块，并进一步揭示了关键信号通路和生物过程事件。这些通路的程序化和持续激活促进了水牛EGA成功。此外研究结果还表明hub基因CDK1在水牛EGA中起关键作用。

本研究绘制了水牛PED中的转录组和DNA甲基化图谱，并深入揭示了水牛EGA的分子机制和水牛MZT期间的遗传编程，这将为改善水牛胚胎的体外发育奠定基础。

图形摘要

研究结果

（1）水牛植入前胚胎发育（PED）过程中的转录组图谱

图1：水牛PED过程中的转录组图谱。A.       水牛卵母细胞和胚胎的显微图像。上图为卵母细胞/胚胎及其透明带。下图为无透明带的卵母细胞/胚胎。从1到9：GV卵母细胞、MII卵母细胞、受精卵、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑椹胚、囊胚（下图中ICM从胚泡中分离）。B.       所有发育阶段转录本的主成分分析（PCA）。C.       无监督分层聚类和重复样本的热图。D.       水牛PED过程中连续发育阶段的DEG数量。E.       每个胚胎发育阶段母体基因表达抑制的数量。F.       每个胚胎发育阶段首次表达基因数量

（2）水牛PED过程中的DNA甲基化图谱

图2：水牛PED过程中的DNA甲基化图谱。A.     每个发育阶段的全基因组CpG甲基化水平。B.     CpG平均甲基化水平（基因体±5 kb）。C.     每个发育阶段CpG不同甲基化水平分布百分比。D.     水牛PED过程中连续发育阶段的DMR数量。A.     几个成对比较中，全基因组中的DMR分布（a：GV卵母细胞与MII卵母细胞；b：MII卵母细胞与受精卵；c：受精卵与2细胞；d：2细胞与4细胞；e：4细胞与8细胞；f：8细胞与16细胞；g：16细胞与桑椹胚；h：桑椹胚与ICM）。B.     以8细胞期为例，CpG甲基化水平与不同表达水平（高、中、低和不表达）相关的变化趋势

（3）WGCNA鉴定阶段特异性共表达模块

图3：利用WGCNA进行阶段特异性基因共表达分析。A.     共表达基因模块的聚类树状图。B.     共表达模块与胚胎发育阶段之间相关性的热图。C.     水牛PED过程中发育步骤示意图

（4）水牛EGA过程中的遗传程序动态变化

图4：主要EGA前富集KEGG通路的互作网络。六边形：2细胞期；矩形：4细胞期；三角形：8细胞期 图5：16细胞期的富集通路和重要KEGG通路分析。A.     KEGG通路在16细胞期富集。B.     水牛PED过程中关键通路的全基因组激活

（5）关键hub基因的鉴定

图6：MZT过程中关键hub基因的鉴定。A.     十大hub基因列表。B.     EGA过程中CDK1的调控通路和相关hub基因。 图7：CDK1富集生物过程的表达热图

研究结论：

本研究利用单细胞RNA-seq和单细胞WGBS技术对水牛卵母细胞和植入前胚胎的全基因组转录组和DNA甲基化进行了测序分析，绘制了水牛胚胎发生过程中的全基因组转录组和DNA甲基化图谱。根据基因表达的动态特征和DNA甲基化变化，揭示了水牛主要EGA发生在胚胎发育的16细胞期。在水牛MZT过程中，hub基因和信号通路的顺序激活对于水牛EGA和水牛PED的遗传编程至关重要。本研究为了解水牛胚胎发生的分子机制提供重要的补充信息，并为改善水牛胚胎的体外发育奠定了基础。

参考文献：

FuP, Zhang D, Yang C, Yuan X, Luo X, Zheng H, Deng Y, Liu Q, Cui K, Gao F, Shi D.Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantationembryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes. J AnimSci Biotechnol. 2023 Jul 11;14(1):94.