引物纯化方式

引物纯化方式

• PAGE纯化：
  PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对引物DNA进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于90%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
• HPLC纯化：
  HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对引物DNA进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。在引物DNA的分析和纯化中，常用的有离子交换（ion-exchange）HPLC和反相（reverse-phase）HPLC。纯化后，引物的纯度可大于90% 。特别适合用于短链（小于40 mer）引物和修饰引物的纯化。
  优点：对纯化短链引物(＜40 mer)特别有效，缺点：成本高，批量生产效率不高。如实验对纯度要求非常高，建议选用HPLC与hPAGE双重精制。纯度大于90%；ion exchange HPLC：纯度大于95%，可以有效的去除N-1短片段。HPLC纯化主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的缺点是成本较高，批量生产效率不高。

• RPC纯化
  RPC纯化是通过反相净化滤芯(Reverse Phase Cartridge)对引物进行纯化，纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较，RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如C18的硅胶，能够很好的吸附DNA，并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、PCR及基因合成等。

  
  金斯瑞生物科技

mer(monomeric unit)是双链核酸中的单位，意即单体单元，相当于nt或者BP都可以。通常用于双链核酸中的单位，100 mer DNA相当于每一条链有100nt。

• HAP纯化（HIGE AFFINITY PURIFICATIION）
  HAP方法是生工自主开发的新型oligo DNA纯化方法。用HAP纯化的引物纯度可达98%以上，完全可与PAGE、HPLC方法媲美。 其原理是利用合成引物5’-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附、而不含DMT的短链DNA不被吸附，从而达到分离纯化的目的。
  HAP方法的三大优势：

1. 纯度高。用其纯化所得引物的纯度高达98%以上 (见图1)。可用于绝大多数分子生物学实验。
2. 快速。用HAP方法纯化的引物一轮只需2小时，因而可比PAGE方法提前一天交货，节约您更多宝贵时间。
3. 价格上更有竞争优势。由于HAP方法与PAGE、HPLC方法相比速度快、成本低，从而节约科研经费。 HAP引物的用途 用HAP方法纯化的引物可用于绝大多数分子生物学实验，包括DNA测序、基因合成、PCR反应、点突变、分子杂交和基因芯片技术等。

Oligo退火：上游+下游引物制备双链DNA

定义
所谓“退火（Annealing）”，是指将材料暴露于高温环境中持续一段时间，再缓慢冷却到低温的热处理步骤。
对于Oligo来讲，退火过程的主要目的是用于形成DNA的高级结构，如茎环、发夹、双链或其他结构。
步骤

1. 溶解oligo
   拿到oligo干粉产品之后，对管子进行瞬时离心，加入退火缓冲液进行溶解。
   推荐溶解成比较高的浓度，建议100 μM以上浓度。如oligo因浓度较高而不溶解，可以加热并搅拌促溶。
2. 浓度测定&混合
   精确测定每个Oligo溶液的浓度，并按照需要的比例进行混合（如等摩尔混合）。如果两条oligo退火形成双链，摩尔数不同会导致多余的单链残留。单链发夹或茎环的退火可跳过此步骤。
3. 退火
   将混合体系加热至94°C，持续2 min，然后缓慢降温（一般情况下将至室温即可）。缓慢降温对形成正确的结构是非常有帮助的，降温过快将导致错误高级结构的产生，推荐的方法是将混合管放入一杯94°C的水中，让其自然降至室温。
4. 稀释&储存
   降温之后，可以用退火缓冲液稀释至需要的浓度并储存于-20°（长期）或4°C（短期内频繁使用）。
   注意
   退火缓冲液的配制
   退火缓冲液配方：10 mM Tris, pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA
   其中：tris起到pH缓冲作用，EDTA起到防止oligo降解的作用，盐离子对于DNA双链的形成是必要的。
   配制退火缓冲液，需要高温灭菌，并使其中的脱氧核糖核酸酶失活，如果用于siRNA退火，需要保证RNase-free.
   适用性
   该方法适用于常规oligo、2-甲氧基修饰、锁核酸等高级修饰的oligo以及短链RNA的退火。
   退火效率检测
   可以通过非变性PAGE胶对变性前的单链oligo以及变性之后的双链oligo同时进行电泳，判断是否退火成功，通常情况下，链长较短时，相同长度的单链比双链DNA的迁移速度要快。但长链oligo由于其本身容易形成高级结构，不推荐进行非变性电泳。