RNA抽提

TRIzol法

1. 细胞准备

   
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   不用pbs洗

2. 转移入ep管中，上下摇混20次， 室温静置5min
3. 加入1/5体积氯仿（ie，1mlTRIZOL加200ul氯仿），大力上下颠倒混匀20次，室温静置5min
4. 4°，12000r/min，离心15min
5. 小心吸取上层水相移入新的1.5mlep管中，加入等体积异丙醇，
   上下颠倒混匀25~ 30次，室温静置10~15min
   勿吸沉淀
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6. 4°，12000r/min，离心10min
   离心后在管侧面和底部形成白色沉淀
7. 弃上清，轻轻加入1ml 75%乙醇（用depc处理水配制而成），让RNA沉淀轻轻漂起来，或者保持原位
8. 4°C， 7500 r/min ， 离心 5min
9. 弃上清，倒扣ep管，室温干燥5-10min
   别掉下来
   此时RNA沉淀微微湿润呈啫喱状
10. 配置原液，白沉淀中加入20ulDEPC处理水
11. 定量：

• 将溶于DEPC处理水的RNA进行适量稀释。
  50倍或100倍稀释（98ul去离子水加2ulRNA或99ul去离子水加1ulRNA，总体积100ul）
• 分光光度计定量，开机后选择RNA定量，先用100ul去离子水做空白读数去除背景，再检测样品，读取OD260值及OD260/OD280比值。

12. q&a

• 纯的RNA其OD260/OD280应为1.8~2.0，如果比值偏小，则有机溶剂或蛋白污染较 严重。如果比值偏大，则RNA可能已发生降解。
• OD260在0.1~1.0之间，OD260/OD280的读数才可信
• RNA浓度= OD260×40×稀释倍数/1000

13. -80保存RNA样本

逆转录
TAKARA RR047A试剂盒 每个复孔 2ul

1. 冰上配制MIXI：

• 1.gDNA Eraser 1ul
• 2. 5X gDNA Eraser Buffer 2ul
• 6. RNase Free dH2O upto 10ul
     total RNA 根据浓度计算体积 2ug/浓度。 算出每个样本取的体积
     离心：shunli

2. 上机：42°，2min，4°， ∞。 MAIN, 047A1, RUN, 20UL, OK, RUN
3. 冰上配置 MIXII

• 上一步骤的反应液 20ul
• 3.PrimeScript RT Enzyme Mix I 2ul
• 4. 5X PrimeScript Buffer 2 (for real time) 8ul
• 5. RT Prime Mix 2ul
• 6. RNase Free dH2O 8ul 总共40ul
     离心（损离），充分混匀，

4. 上机 37° 15min，85° 5sec， 4° ∞ 。 RECENT, SYBR2, 40UL
   测定RNA 浓度决定体系体积：
   测RNA浓度机器：开机，选nucleotide，选择RNA.，清洗。 用水2ul，洗红点。擦掉。加2ul水，选择Blank，样本吸2ul，选择Sample，记下rna浓度。