甲基化系列 1. 甲基化之前世今生（Methylation）

  

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    最近刚好有点小业务做甲基化，甲基化对于我来说再熟悉不过了，因为生信入行就一直做甲基化，从植物做到动物，又从动物做到癌症，甲基化不同类型，DNA甲基化，RNA甲基化，以及组蛋白甲基化都非常熟悉，这里就先从胞嘧啶甲基化（5mC）说起，因为好多老师问GEO/TCGA的270K, 450K, 850K的数据都怎么分析，今天开始连载几篇表观遗传学相关数据的处理以及后续SCI文章内容该怎么分析等！！

表观遗传学

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic imprinting），母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等。所以说表观的修饰只是改变基因的表达而不改变基因本身。

表观遗传改变主要从四个层面调控基因表达
（1）DNA甲基化：DNA共价结合甲基基团，使相同序列等位基因处于不同修饰状态；（2）组蛋白修饰：通过对结合DNA的组蛋白进行不同的化学修饰实现对基因表达的调控；
（3）染色质重塑：通过改变染色质的空间构象实现对基因表达的调控；
（4）非编码RNA的调控：RNA可通过某些机制实现对基因转录和转录后的调控。

举个例子：同卵双生的双胞胎个体，从遗传学角度说他们的DNA序列是一致的，但多种表型存在一些差异。经典的孟德尔遗传定律和生物学表型之间还存在另外一层调控因素，即表观遗传。

DNA甲基化

DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

DNA甲基化是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一。广义上的DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化作用下，以S—腺苷甲硫氨酸（S—adenosyl methionine，SAM）作为甲基供体，通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程。这种DNA甲基化修饰可以发生在胞嘧啶的C—5位、腺嘌呤的N—6位及鸟嘌呤的G—7位等位点。一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，其产物称为5—甲基胞嘧啶（5—mC），是植物、动物等真核生物DNA甲基化的主要形式，也是发现的哺乳动物DNA甲基化的唯一形式。DNA甲基化作为一种相对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制。

基因组中DNA的甲基化模式是通过DNA甲基转移酶实现的。DNA甲基化酶分为2类，即维持DNA甲基化转移酶（Dnmtl或维持甲基化酶）和从头甲基化酶。根据序列的同源性和功能，真核生物DNA甲基化转移酶又分为4类：Dnmtl/METl、Dnmt2、CMTs和Dn-mt3。DnmtliiMETl类酶参与CG序列甲基化的维持。CMTs类酶仅发现在植物中，主要特征是它的催化区T和Ⅳ包埋染色体的主区，并且特异性地维持CG序列的甲基化。Dnmt:3类酶在小鼠、人类和斑马鱼中得到鉴定．Dnmt3a和Dnmt3b在未分化的胚胎干细胞中高度表达，但在体细胞中表达水平很低。它们的主要作用是从头甲基化，但对维持甲基化也起到一定的作用，并且负责重复序列的甲基化。

CpG甲基化
C位点的甲基化主要发生在CpG序列上。CpG二核苷酸中的C常常被甲基化。在哺乳动物中CpG以两种形式存在：一种是分散于DNA序列；另一种呈现高度聚集，为CpG岛。在正常组织里，70%~90%分散的CpG是被甲基修饰（对维持基因族的稳定性具有重要作用），而位于基因转录调控区域CpG岛中的CpG则往往是非甲基化的（有利于转录因子和转录调控区域结合，影响下游结构基因的转录）。

CpG岛常常位于基因启动子区域以下面这个基因为例，红色竖线代表CpG位点，下面是APRT这个基因的第一外显子和第二外显子，可以看到CpG位点集中于启动子区域，第一外显子和第一内含子区域。

启动子区域CpG位点甲基化影响基因转录
以下图为例，黄色部分是CpG位点中的C位点，当其为非甲基化时，转录因子和辅助转录蛋白可以顺利地结合在转录的其实区域，从而推动下游基因的转录。
然而，当C被甲基化之后，空间结构发生了变化，转录因子和辅助转录蛋白不能结合在转录其实区域，最终造成基因转录的抑制。因此，甲基化常常通过基因的转录来调控基因的表达。

肿瘤细胞中CpG位点甲基化变化
以肿瘤细胞中CpG位点甲基化变化为例，上一张图是正常细胞，左边是肿瘤抑制基因，右边是分散的CpG位点，在正常细胞的肿瘤抑制基因中，CpG位点通常是非甲基化的，因此这些基因是可以表达的。在分散的CpG位点当中常常是甲基化的。
在下方的肿瘤细胞当中，肿瘤抑制基因CpG位点中的C常常是甲基化的，造成该基因表达沉默，但分散CpG位点中的C常常是非甲基化的。
因此，这样造成抑癌基因表达缺失，同时造成整个基因组的不稳定。

甲基化检测方法

基于芯片的甲基化检测方法

DNA 甲基化作为重要的表观遗传学的标记，能够调控基因的表达，在生长发育和疾病相关研究领域都有着重要意义。测定甲基化的手段有很多，芯片作为一种成熟的手段，其稳定性，可重复性以及性价比，使得在DNA甲基化研究领域芯片占据了半壁江山。

对于human 来说，目前主流的DNA甲基化芯片有450K 和 850K 两种，都是illumina 公司研发的。这里的 450K 和 850K 指的是芯片上探针的数量，对应可以检测的甲基化位点个数。

在GEO 数据库中，每种芯片都有对应的GPL 编号，450K 芯片的链接如下：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL13534

850K 芯片的链接如下：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL21145

打开上面的链接，可以看到对应芯片的详细信息，我们来看下每种芯片探针的数量

1. 450K 芯片的探针数量：Total number of rows: 485,577

2. 850K 芯片的探针数量：Total number of rows: 868,564

从具体的探针数目也可以看出， 450K 和 850K 是1个约数，用来表明探针的数量，覆盖的甲基化位点的个数。

探针是以甲基化位点为单位的，每个探针对应检测一个甲基化位点。为了能够区分甲基化位点和非甲基化位点，在450K 和 850K中，有两种类型的探针，分别叫做I 型探针和 II 型探针。示意图如下：

亚硫酸氢盐处理的DNA ，非甲基化的C会变成T , 而甲基化的C不会变。

对于I 型探针而言，有两种序列，专业名词叫做bead type， 其中Unmethylated bead type 用来和非甲基化的C杂交，Methylated bead type 用来和甲基化的C杂交。可以看到两种bead type 只有末端最后1个碱基不同，A 碱基用来杂交非甲基化的C, G碱基用来杂交甲基化的C。

ID    cg00050873AlleleA_ProbeSeq    ACAAAAAAACAACACACAACTATAATAATTTTTAAAATAAATAAACCCCAAlleleB_ProbeSeq    ACGAAAAAACAACGCACAACTATAATAATTTTTAAAATAAATAAACCCCG

对于II 型探针而言，设计得比较巧妙，它只需要1个bead  type, 探针只涉及到甲基化位点的前一个碱基，在DNA 链的延伸阶段，根据延伸的碱基是A 还是 G , 从而判断是甲基化的C 还是非甲基化的C。下面是450K 上一个II 型探针的示例：

ID    cg00035864AlleleA_ProbeSeq    AAAACACTAACAATCTTATCCACATAAACCCTTAAATTTATCTCAAATT

    下期介绍GEO/TCGA数据读取与处理，敬请期待！

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