利用免疫治疗队列构建治疗效果精准评分，9分Oncogene，值得
今天给大家推荐一篇文章，是利用免疫治疗队列开发免疫治疗效果评分模型，其亮点在于巧妙的利用生物信息进行了标志物的开发和模型构建，文章发表在Oncogene，影响因子相当可以。整个技术路线对于生信人的老朋友来说，是相当的熟悉，目前免疫治疗的公开数据还挺多的，完全可以参考这个思路挖一挖
CD8+ T effector and immune checkpoint signatures
predictprognosis and responsiveness to
immunotherapy in bladdercancer
Hello,免疫检查点抑制剂是目前治疗肿瘤的最为先进的方案之一，但是一些患者对该治疗方案并不敏感。如何解决这个问题呢？小王本次给大家讲解的就是2021年发表在杂志Oncogene(IF: 9.8)的一项研究，该作者是从CD8+T效应（CD8 Teff）出发研究出一个预测模型进而对该治疗方案的效果进行预测。接下来为大家讲解作者是如何一步一步分析的。
STEP1 WGCNA的构建和关键模块的识别
（1）确定重要的模块基因
作者从IMvigor210队列中纳入了348位转移的尿路上皮癌患者的样本，并选择了方差大于不同样本中所有四分之一方差的基因。作者共获得了2351个基因用于进行WGCNA，并将这些基因用聚类树状图划分为5个不同的模块。根据CD8+T效应与免疫检查点的相关性，最终确定黄色的模块基因作为构建模型的基因集。如下图1
图1
（2）对模块基因进行富集分析
对模块基因GO与KEGG富集分析，GO功能分析结果为T细胞活化、质膜外、细胞因子受体结合等功能。KEGG结果为造血细胞谱系、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、结核性膀胱通路相关。
STEP2 IMS（免疫靶点抑制剂评分）作为一种预测因子的潜在生物学作用
(1)构建ssGSEA评分
根据黄色模块基因构建了ssGSEA的评分系统，并量化了每个样本的预后水平，简称IMS。（划重点）
(2)高、低IMS组的在分子分型或基因之间的分布
将高、低IMS组按照TCGA和Lund分类进行比较，第I亚型在低MIS组中最常见，而第IV亚型最少见。Lund分类中包含一个基因组不稳定的亚型，低IMS组的UroA亚型和高IMS组的Inf亚型所占比例最高。与高IMS组相比，低IMS组有更多FGFR3突变的患者。见图2
作者研究显示，低IMS组FGFR3基因标记(FGFE3、TP63和WNT7B)的表达显著增加，而CD8 Teff标记、抗原加工机制;免疫检查点等相关基因在高IMS组比低IMS组高表达。
图2
(3)IMS与生存
IMS的生存分析显示，在抗PD - L1免疫治疗队列中，低IMS组的生存获益较差。（K-M曲线，很常规啦）
图3
(4)IMS与治疗应答
客观应答组(CR/PR:完全缓解或部分缓解)的IMS显著低于非应答组(SD/PD:疾病稳定或进展)。图4
图4
(5)IMS与肿瘤PD-L1表达量之间的关系
随着肿瘤细胞PD-L1表达等级的增加，IMS显著增加。不同免疫表型间IMS也有显著差异。
STEP3 IMS的免疫治疗反应性
可以认为该步骤是对IMS与其它参数之间的关系，也是IMS的应用效果的评估。
(1)利用TIDE算法并对其相关指数进行分析
作者使用外部2031例膀胱癌样本计算出IMS随后再评估TIDE算法(图5)，结果显示IMS与TAM _M2和MDSC水平呈负相关，与CAF含量呈正相关。IMS与功能障碍呈正相关，与EXCLUDE呈负相关。IMS和TIDE评分之间有很强的相关性。
图5
(2)免疫浸润
随后，作者们评估了IMS与24种免疫细胞的相关性，发现IMS与M0、M1、M2巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞CD8、活化NK细胞、嗜酸性粒细胞呈正相关。 记忆B细胞、记忆活化T细胞、CD4 T细胞和γ δ T细胞的免疫浸润水平在高IMS组明显低于低IMS组。见图6
图6
(3)IMS与信号通路的相关性
作者IMS与膀胱癌重要生物学通路的基因评分进行相关性分析，发现IMS与免疫检查点、CD8 T效应、APM、EMT1、EMT3评分呈正相关，与FGFR3相关、TCGA评分呈负相关。见图7
图7
(4)IMS与ESTIAMTE算法
此外，经计算，高IMS组的肿瘤纯度显著高于低IMS组。低IMS组的ESTIMATE、免疫和间质评分显著高于高IMS组。见图8
图8
STEP4 中枢基因的评估
(1)确定hub基因
作者利用Cytoscape软件的Cytohubba和MCODE功能，在黄色模块中寻找10个最重要的中枢基因(B2M、CD274、HAVCR2、CD33、CD14、FOXP3、LY96、BTK、DYSF和CD300A)。随后也分析了hub基因可能涉及的通路，提示可能启动膀胱癌细胞凋亡、EMT和ER激素信号通路，并抑制PI3K/Akt通路、TSC/mTOR通路、细胞周期、DNA损伤反应和AR激素，受体酪氨酸激酶(RTK)。图9
图9
(2)临床意义分析
膀胱癌中Hub基因的表达，CR/PR组的CD274和B2M表达明显高于SD/PD组。
(3)生存分析
B2M和CD274高表达患者的生存时间显著长于低表达患者，而CD300A表达较高的患者生存时间较短。
(4)B2M与膀胱癌免疫浸润的相关性
作者特别研究了B2M基因，
首先，免疫组化分析显示B2M在肿瘤组织中的表达高于正常组织。
接着多色免疫荧光染色探索B2M之间的相关性和肿瘤微环境。量化B2M +细胞距离肿瘤组织不同距离梯度。（图10）
图10
量化了不同B2M+细胞浓度梯度内CD8+ T细胞和CD68+巨噬细胞的数量（图11），并认为三者之间存在关联性。
图11
（5）拷贝数变异与免疫相关基因的表达
作者利用GSCALite web服务器挖掘公共癌症基因表达和预后数据库。使用该服务器分析11,160个TCGA样本的多组学数据。对Hub基因mRNA在泛癌中的表达及其预后分析显示，肾脏肾透明细胞癌(KIRC)中Hub基因高表达与总体获益显著相关，而在肺鳞癌(LUSC)中观察到相反的趋势。
STEP5 风险预测模型的构建与验证
(1)构建模型
以黄色模块基因为基础，将IMvigor210队列中的患者按7:3的比例随机分为训练组(244个样本)和验证组(41个样本)。采用LASSO Cox回归分析构建由CXCL13、ZYX、SPHK1、TLR2、MEFV、TNFSF14、UBD、LAG3 8个基因组成的风险预测模型。在模型验证中，训练组和验证组中的高危组的死亡率明显高于低危组；内部验证集进一步验证，得到了一致的结果。ROC曲线分析评估风险预测模型的敏感性和特异性，结果验证所建立的风险预测模型的预测值(训练集:1年AUC = 0.767, 3 / 5年AUC = 0.835;验证集:1年AUC = 0.638, 3 / 5年AUC = 0.719）
(2)风险评分对患者预后的影响
单变量Cox回归分析表明，使用PD-L1免疫抑制剂治疗的膀胱癌患者的风险评分与较差的生存期相关，并且是较差OS的重要预测因子。多因素Cox回归分析采用单因素Cox回归分析中具有统计学意义的特征因素，风险评分为独立的危险因素。
STEP6 风险预测模型的预后价值评估
进一步分析模型基因发现CXCL13和LAG3等基因在CR/PR中的表达显著高于SD/PD ，而ZYX和TLR2的表达则相反。
（1）评估风险模型与24个免疫细胞之间的相关性。
8个风险预测模型基因与大多数免疫细胞显著相关。风险预测模型基因与记忆B细胞、活化树突状细胞、静息树突状细胞等呈正相关。提示这8个风险预测模型基因可能对免疫细胞浸润有调节作用。值得注意的是CXCL13表达于卵泡辅助T细胞本身，并且包含在用于定义卵泡辅助T细胞亚群的基因集中。
（2）逐个基因分析
使用风险预测模型的生存分析显示 SPHK1、TLR2和ZYX高表达患者的生存时间更短。然而，CXCL13、LAG3和UBD高表达组的生存时间明显长于低表达组。
（3）重点基因分析
首先，免疫组化分析显示，CXCL13在肿瘤组织中的表达高于正常组织。
接着，不同距离梯度下的肿瘤细胞数量，我们发现距离肿瘤细胞越远，细胞总数和CXCL13+细胞数量逐渐减少（图12）。
图12
肿瘤癌巢中CXCL13+细胞数量(27.15%)远低于肿瘤间质中CXCL13+细胞数量(72.85%)。离CXCL13+细胞越远，CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞的数量逐渐减少，这些结果表明，CXCL13+细胞可能与CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞有积极的相互作用。
STEP7 风险预测模型基因的泛癌分析
（1）与免疫浸润之间的关系
首先，作者发现这八个基因的变化可能会影响免疫细胞浸润水平并且研究了30种癌症中，发现在大多数癌症中ZYX的表达受到CNV的显著调控，其次是TLR2和SPHK1。我们分析了33种癌症中每个风险预测模型基因的杂合/纯合CNVs的组成。
（2）在正常组织与癌症组织中表达是否存在差异
又比较了模型基因在肿瘤组织和正常组织中的表达，发现在肾透明细胞癌中所有风险模型基因表达的差异最大。SPHK1、UBD和LAG3在LUSC中的表达水平高于正常细胞，而TLR2、MEFV、ZYX和TNFSF14的表达水平则相反。
（3）对临床亚型的影响
模型基因对临床癌症亚型的影响，对乳腺癌、肾透明细胞癌、肺鳞癌、肺腺癌是最显著的。
（4）对信号通路的影响
在信号通路起始阶段，模型基因主要启动凋亡、EMT和激素信号通路;但它们在细胞周期、DNA损伤反应、AR和ER激素以及rtk中发挥抑制作用。
STEP8 建立预测生存的Nomogram
基于单因素和多因素Cox回归分析结果，确定危险因素构建了包含10个独立预后因素(β(X-m)项、风险评分、同源重组、免疫检查点水平、fancori、免疫检查点效应因子、DNA损伤修复基因、CD8+ Teff、TNB和TMB)，来预测免疫靶点抑制剂治疗膀胱癌患者的生存率(图13)。每个患者对每个预后参数进行评分，总评分表明该患者预后较差。此外，校准图提示该模型具有与理想模型相似的性能。决策曲线分析(DCA)也得到了结果。
图13
