8.4分非肿瘤生信，免疫浸润+机器学习+动物模型验证。可谓是非肿
影响因子：8.44
研究背景：
冠状动脉疾病(CAD)仍是全球主要死亡原因之一。动脉粥样硬化病变通常导致进行性冠脉狭窄、心肌缺血、坏死，最终累积急性心血管综合征(ACS)的风险。外周生物标记物是监测冠状动脉疾病(CAD)进展的越来越重要的非侵入性方法。近年来的证据表明，免疫紊乱在CAD病理过程的启动和发展中起着决定性作用。
研究结果：
一、外周血中差异mRNA表达的鉴别
1、本研究中一共有199例CAD患者和218例对照组的外周血转录组。PCA分析GSE20680，GSE20681 和GSE42148表明，批次效应在三个基因集中已被去除（图2A，B）。
2、共鉴定出762个DEGs，其中上调基因396个，下调基因366个(图2C)。
3、热图显示CAD患者与对照组之间的前17 DEGs，提示其可能参与CAD的病理过程（图2D）。
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二、DEGs的功能富集分析
1、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络说明了蛋白质水平上的交互关系（图3A）.
2、GO分析显示DEGs涉及的分子功能，生物过程和细胞成分（图3B）。
3、KEGG通路富集分析显示，DEGs集中于5种与免疫相关的信号通路，其中以细胞因子与细胞因子受体相互作用的信号通路最多（图3C）。
三、DE-IRGs测定和免疫相关细胞图谱分析
1、韦恩图（Venn）显示，上述CAD患者的DEGs与IRGs中，交集到58个DE-IRGs（图 4A）。
2、热图显示，主要有28种免疫细胞发生改变（图4B），箱式图显示CAD患者和对照组间，免疫细胞富集分数的差异（图4C）。其中，活化的树突状细胞、肥大细胞、中性粒细胞、Th17细胞和MDSC在CAD中的比例增加，活化的B细胞和CD56细胞的比例减少。
3、气泡图显示，发生改变的28中免疫细胞存在相关性（图4D）。例如，活化的CD4+ T细胞和Th2细胞具有相关性（r=0.55），中性粒细胞和血浆树突细胞具有相关性（r=0.62）。
四、CAD中14个关键外周DE-IRGs的鉴定及免疫诊断模型的构建
1、通过LASSO回归分析，最终确定14个基因，构建CAD诊断模型（图5A、B）。
2、利用ROC曲线评价14个基因的诊断效果（图5C、D），其中14个基因ROC曲线下面积：CCR9 (AUC=0.686), CER1 (AUC=0.604), CSF2 (AUC=0.688), CXCL2 (AUC=0.589), HTR3C (AUC=0.699), IL13RA1 (AUC=0.650), IL1A (AUC=0.667), INSL5 (AUC=0.624), MBL2 (AUC=0.619), MMP9 (AUC=0.649), MSR1(AUC=0.679), NR4RA2(AUC = 0.657), NTS(AUC = 0.667) and TNFRSF19 (AUC=0.686)。
3、ROC曲线分析上述14个基因的诊断模型训练集（图5E、F），当14个基因都包含在一个诊断模型中时，训练数据集和测试数据集的AUC分别为0.968和0.859。
五、CAD患者外周血免疫特性分析
1、箱式图显示，外周血中所鉴定的mRNA中，14个关键外周DE-IRGs在CAD组与对照组之间有显著差异（图6A）。其中, CCR9, CER1, CSF2, IL13RA1, INSL5, MBL2, MMP9, MSR1, NTS 和TNFRSF19基因上调表达, 而CXCL2, HTR3C, IL1A,和NR4A2基因表达下调。
2、气泡图显示，这些基因大多数具有正相关的关系（图6B）。
3、多种免疫成分在CAD诊断和病理机制中的重要作用，热图显示了14个CAD中DE-IRGs和28种免疫细胞相关性，以此分析免疫成分与冠心病之间的相互关系（图6C）。
六、在体内验证10个候选DE - IRGs与CAD的相关性
1、小鼠主动脉弓油红O染色显示，20周小鼠主动脉弓内大量脂质斑块聚集，导致管腔狭窄（图7）。
2、对于体重发现，CAD模型组平均体重明显高于对照组（图7B）。
3、CAD组外周循环低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯(TRIG)水平升高（图7C、D）。
4、全血总mRNA检测结果显示，CAD模型组CCR9、CSF2、IL13RA1、NTS表达明显高于对照组（图7E-H、M）。
5、但是IL1A，在模型组中也有升高，与预测数据结果相反（图7I）。
6、然而，CXCL2、INSL5、MSR1、NR4A2和TNFRSF19在CAD模型组和对照组间无差异 (图7G，J-L，N)。
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七、IL13RA1激活JAK1/STAT3通路，调节CAD中巨噬细胞功能
1、细胞实验中，ox-LDL处理使BMDMs中IL13RA1 mRNA的表达增加，并且激活了JAK1/STAT3信号通路，而且使VEGF-C的产生增加（图8A，B-E）。
2、动物实验中，在HFD饮食诱导的20周龄LDL缺失小鼠(CAD小鼠模型)的主动脉中，IL13RA1 mRNA表达、p-JAK1、p-STAT3、VEGF-C和IL-6蛋白水平升高(图8C，D-F)。
3、免疫荧光图可见转染siRNA的RAW264.7细胞中有良好的转染效果(图8G)， IL13RA1 mRNA表达被显著减少 (图8H)，并且磷酸化的JAK1和STAT3、VEGFC、TGF-β和αSMA的表达水平降低 (图8I，J)。
4、IL13RA1敲除组中SCARB1和ox-LDL处理组的CD36 mRNA表达水平降低（图8M、N）。然而，IL13RA1敲除却增加了IL-6的表达量 (图8I，J)。
5、油红O染色结果显示IL13RA1敲除组巨噬细胞吸收的脂滴减少（图8K，L）。
研究总结：在该研究中，作者利用数据库中筛选的14个关键性的差异表达免疫相关基因(DE -IRGs)的基础上，构建了晚期CAD诊断模型。然后，作者使用低密度蛋白受体缺陷小鼠(典型的CAD动物模型)来确定候选基因与CAD的相关性，其中IL13RA1可能通过调节JAK1/STAT3通路参与动脉粥样硬化的炎症、纤维化和胆固醇分泌过程。
