论引物特异性的重要性，顺便带你看懂花花绿绿的结果

写在前面

常做分子实验的小伙伴们，一定都离不开引物设计，其重要性我相信不用多说。而在我们设计引物的过程中，引物的特异性往往决定PCR的产物是否有杂带，从而影响下游实验，直接影响实验的成功与否。

设计常规PCR引物，可以参考这篇文章中的评论部分：https://www.omicshare.com/forum/forum.php?mod=viewthread&tid=4005&fromuid=38668

评论区部分截图

设计定量PCR引物，可以参考公众号中这篇文章：

文章题目 文章部分截图

正文来了

今天主要说说如何通过 NCBI blast 验证引物特异性，以及 blast 之后的结果解读。

主页选择 BLAST 比对引物肯定是选第一个哈

Blastx：将给定的核酸序列按照六种阅读框架将其翻译成蛋白质与蛋白质数据库中的序列进行比对。作用：对分析新序列和EST很有用；

Tblastn：将给定的氨基酸序列与核酸数据库中的序列（双链）按不同的阅读框进行比对。作用：对于寻找数据库中序列没有标注的新编码区很有用；

比对引物的具体操作见下图：

20个也就是长按键盘上的n，默数三秒吧 按照步骤操作即可，有特殊需求可自行更改数据库

然后，我们就可以看到分析结果，主要分为四大部分。

1）Description，结果的简要信息。

左边是基因物种和名称，右边比较重要的参数有：

Total score 越高，代表引物理论上可以扩增到目的片段；

E value代表被比对的两个序列不相关的可能性，e值越小，相关性越强；

Accession：数据库中该基因对应的唯一编号，点击可获得该序列信息。

Description部分

2）Graphic Summary，结果的图片形式。

Alignment Score：不同的颜色代表序列与引物匹配的得分值，分值越高，特异性越好；

粗线条表示上下游引物，两个粗线条中间有连线的表示：这些序列不仅与上下游引物匹配，且理论上可以扩增出基因片段，应优先选择；

点击线段，可跳转至基因结果信息概要。

Graphic Summary 部分

3）Alignment，结果的详细信息。

Strand代表引物与序列同向or反向，Plus/Plus即正向，Plus/Minus则反向；

identities表示匹配的部分，gaps则表示未匹配部分。

Alignment部分

4）Taxonomy，生物学分类。

根据比对结果中不同物种出现的次数进行统计，判断你的基因来自于什么物种。

 Taxonomy 部分

需要注意的是，除了参考以上参数，如果找到了你的目的基因名称，同时也找到了许多同物种的不同基因，且分数也较高。这时表明你的引物设计的特异性不高，极有可能在你的扩增产物中出现非特异性产物，建议重新设计引物。

当然了，以上这些都是通过一些参数判断你的引物是否特异，合理运用会节省很多时间，但是最终还是需要实验验证，毕竟实践出真知对吧。祝你们好运~