学习小组DAY7 测序-嗷呜
2022-03-09 本文已影响0人
嗷呜嗷呜www
今天学习内容是测序。学习资料主要来源：微信公众号生信星球
一、一二三代测序 [1] [2] [3]
思维导图对测序的原理、优缺点进行了简短的总结，各项技术参数的对比如下，本文正文部分主要对测序原理进行梳理。
图源网络
1. 一代测序原理
DNA双脱氧链终止法：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（ddATP,ddCTP,ddGTP和 ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
一代测序原理
2. 二代测序原理
第二代测序技术：Roche公司的454技术、illumina公司的 Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术，此处主要介绍illumina公司的测序原理。
Illumina
这部分内容可以看b站【陈巍学基因】视频1 ，讲得非常清楚。
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DNA待测文库构建
利用超声波把待测的DNA样本打断成200-500bp长的小片段，然后通过末端修复、磷酸化、加A等步骤修补成平末端，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。 -
Flowcell
Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，建库完成后，文库中的DNA在通过 flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头（共价结合），这些接头能和加在DNA片段两端的接头相互配对，DNA后续在其表面进行桥式PCR扩增。 -
桥式pcr扩增
Flowcel上面连有两种接头（P5、P7），当DNA经变性后流经Flowcell时，利用Flowcell上的接头与DNA两端的接头相互匹配。DNA进行桥式PCR扩增，从而将碱基信号放大。通过桥式PCR不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。 -
测序
边合成边测序。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有特异荧光标记的4种dNTP。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录， 最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。 - 数据产出
3. 三代测序原理
SMRT技术
边合成边测序，以SMRT芯片为测序载体，芯片上众多小孔中的DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)，在碱基配对阶段，加入不同碱基会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。另外，若碱基存在修饰，则通过聚合酶的速度会减慢，因此可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间、两峰之间的距离来检测甲基化等碱基修饰情况。
纳米孔单分子测序技术
当在膜两侧施加电压，分子马达驱动DNA分子通过纳米孔，导致电荷发生变化，每种碱基引起的电流变化是不同的，通过检测这些电流进而转化为对应的碱基序列。
二、组学的相关名词及应用[4]
详见思维导图，重点学了一下基因组学和转录组学（因为是我的方向·ω·）
三、测序的发展史[5]
测序发展史，图源网络
今天的思维导图：
Day7思维导图
参考文章：
