基因编辑的难易二三事儿

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基因编辑（gene editing），也叫做基因组编辑（genome editing），是在特异性人工核酸内切酶技术基础上针对目标生物基因组实现对特定 DNA 序列的删除、插入或修饰，从而获得具有特定遗传信息的生物材料的一种生物技术手段。包括基因的定点敲除、敲入和点编辑等基因组操作。近年来在哺乳动物细胞中，随着 CRISPR/Cas9 技术的兴起和普及，利用该编辑工具在基因组目标位点引入双链断裂（Double strand break, DSB ）后进行目的基因的改造成为大热。

 1.什么是CRISPR/Cas9?

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats( CRISPR )是常间回文重复序列丛集，存在于大量的细菌和古细菌的基因组中，该类基因组中含有曾经攻击过该细菌的病毒的基因片段，属于一种获得性免疫。细菌利用”记忆“这些病毒基因组片段来侦测并抵抗相同病毒的攻击，并摧毁其 DNA 。Cas9 是 CRISPR 基因座相关的一种蛋白，具有核酸酶活性，负责对靶位点（DNA）切割工作。

附上CRISPR研究领域大神张锋团队参与制作的CRISPR工作原理视频，便于大家直观了解。

CRISPR-Cas9基因编辑的原理（张锋参与制作）_腾讯视频

2.CRISPR/Cas9为什么火了并持续火着？

说到底，CRISPR/Cas9是一种人工核酸酶（artificial nuclease）。人工核酸酶的发展大致分为四个时期：

1）大范围核酸酶(Meganucleases)是最早被应用于基因组靶向修饰研究的核酸酶。 Meganucleases 识别的 DNA 序列比普通的核酸内切酶长，一般是12~40 bp，这种长度的 DNA 序列在基因组中一般不会有脱靶位点，能够保证 Meganucleases 的特异性。但是针对特定位点的 Meganucleases 的筛选和改造非常困难，这在很大程度上限制了 Meganucleases 的广泛应用。

2）1996 年第一代人工核酸内切酶技术—锌指核酸酶(Zinc finger nucleases， ZFNs)的诞 生为基因组编辑研究领域带来新的契机。Kim等人在体外研究中首次将来源于真核生物转录因子的锌指蛋白 (Zinc Finger Protein， ZFP)与 FokI 核酸酶的切割域进行融合，进而实现了对特定 DNA 分子的高效特异性切割。锌指核酸酶通过锌指蛋白来特异性的识别靶序列(分左右两侧)，进而引导不具有切割活性的 FokI 切割域单体在特定靶序列上形成具有非特异性切割活性的二聚体，并最终实现对靶序列的特异性切割。（如下图）

一个锌指核酸酶单体一般需要3 个或以上的锌指蛋白模块来保证对靶序列识别的特异性，而一个锌指蛋白模块识别的是3 个碱基；这样略显繁琐的识别方式在保证脱靶率很低的同时也限制了该核酸酶的改造以及靶位点的选择。加上随后出现的二代基因编辑工具（TALEN），锌指核酸酶渐渐淡出研究者的视线。

3）第二代由FokI介导的特异性人工核酸内切酶技术—TALE核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs,)。TALENs 通过TALE (Transcription activator-like effector) 蛋白对靶序列(分左右两侧)的特异性识别来募集不具有切割活性的FokI切割域单体，进而在特定靶序列上形成具有非特异性切割活性的FokI 二聚体，实现对靶序列的特异性识别和切割。（如下图）

与锌指蛋白相比，TALENs 的TALE DNA 结合域具有更高的特异性，可以通过直接组装来获得。但是，TALENs 需要含有12~18 个TALE 重复单元以保证其对靶序列识别的特异性，而这些TALE 重复单元是高度同源的；因此，TALE 核酸酶构建和改造限制了该技术的普及和应用。

4）现在基因编辑中最常用的是来源于酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes，S. pyogenes）中的II型CRISPR/Cas9，该系统中的crRNA 和tracrRNA 连接起来所形成的导向RNA 分子(single-guide RNA, sgRNA 或gRNA)，能够介导Cas9 蛋白对特定DNA 分子的靶向切割。靶位点长度为20个碱基，唯一的限定条件是靶序列3’端需要有PAM序列（常见为NGG，N代表任意碱基）。CRISPR/Cas9核酸酶能够通过一个很小的RNA分子实现其对DNA 靶序列的特异性识别和切割，改造起来比依赖于ZFP 蛋白的锌指核酸酶和依赖于TALE 蛋白的TALE 核酸酶具有更大的优势。自2013年成功用于编辑DNA 起直到如今，都是基因编辑领域中的重要操作工具。

3.CRISPR/Cas9在疾病治疗领域的应用

自张锋等成功利用此技术编辑了人类细胞，CRISPR的适用范围就一直在扩大；比如通过体细胞编辑技术来治疗一些罕见的基因疾病 (例如：Leber先天性黑朦10型患者LAC10，一种视网膜退行性病变；肌肉疾病：假肥大型肌营养不良症；非恶性血液疾病；肺部疾病：囊肿纤维化；肝脏疾病：α-1抗胰蛋白酶缺乏症；癌症等)，以及农业上一些选育的应用。

4. CCR5治疗艾滋病不仅仅是敲除它这么简单

CCR5，全称为C-C趋化因子受体5 (C-C Chemokine receptor 5)，目前已在此基因的编码区和启动子区域发现了多种有意义的突变，尤其以对基因编码区突变体CCR5△32的研究最为广泛。CCR5△32是指CCR5 基因中有32 个碱基的缺失，使CCR5 蛋白无法正常穿膜表达于细胞膜上，进而使HIV1 病毒不能进入宿主细胞。CCR5 △32基因型被发现于欧洲，大约有10%的欧洲人天然携带该缺陷型CCR5 基因（CCR5 △32）并且可以抵制艾滋病毒的侵染。故CCR5 基因成为了研究艾滋病治疗的首选热门基因。但是CCR5不仅仅只与艾滋病有关，该基因与人体其它重要免疫功能也密不可分，比如具有调控T 细胞和单核细胞/巨嗜细胞系的迁移、增殖与免疫的功能。

近日就有来自加州大学洛杉矶分校的神经生物学家Alcino J. Silva发文章表明敲除CCR5 基因这不仅可以使老鼠更聪明，提升认知功能而且还能改善中风后的大脑恢复问题，甚至还与学生在学校是否能取得优异的成绩有关。简单来说，CCR5 基因突变可能会影响人的认知功能。

不仅如此，CCR5 基因的存在能够抵御一些严重传染病。比如，CCR5蛋白能调动关键免疫细胞对抗肺部病毒，如果没有这个基因，这一防御系统就会溃败，从而使CCR5 缺失的个体死于流感的风险是普通人的4 倍。此外，CCR5 基因公认对西尼罗病毒、蜱传病毒、登革热和黄热病病毒等具有防护作用。

尽管如此，对于CCR5 基因的功能以及缺失后产生的代价我们还没有完全了解，这也许比我们想象的要复杂的多，所以对该基因的编辑还是应该慎重再慎重。

CRISPR/Cas9 对PAM（NGG）序列的高度依赖使得其成为一把“双刃剑”，一方面，CRISPR/Cas9 系统理论上可以在任何含有PAM 序列的靶位点处进行高效切割；但另一方面，对PAM 序列的高度依赖又将成为限制其进行基因组编辑的障碍。并且现有技术只能预估处潜在的脱靶位点，伴随着一定的脱靶概率，即使检测并排除了潜在预估脱靶位点的不良影响，也无法肯定在庞大的基因组上的其他位置没有任何损伤。

基因编辑看似只需要一个核酸酶蛋白以及一个导向RNA ，操作简便，但其潜在的影响我们还无法得出结论。

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排版：小丸子