文献解读 | 单细胞测序鉴定肺癌中新抗原反应性T细胞的表型特征
多种成功的癌症免疫疗法的核心是T细胞识别肿瘤特异性突变（新抗原）。这种疗法可以通过过继性转移能够产生新抗原反应T细胞受体（TCR）的T细胞来增进疗效，但如何快速有效地在癌症患者中鉴定新抗原反应性T细胞，一直是进一步鉴定和利用这些靶标上待解决的问题。
2022年5月9日，美国国立卫生研究院的James C. Yang团队在Cancer Cell杂志上发表了一篇题为 A phenotypic signature that identifies neoantigen-reactive T cells in fresh human lung cancers 的研究论文。在该研究中，作者通过对非小细胞肺癌（NSCLC）的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行CITE-seq和TCR- seq测序分析，挖掘了新抗原反应性T细胞的特征，并基于该策略下的数据特征筛选，成功鉴定出新抗原反应性TCR（其中CD8+ T 细胞的成功率为45%，CD4+ T细胞的成功率为66%），展示了一种新型且快速鉴定新抗原反应TCR的方法，为个性化新抗原反应T细胞的工程化进程提供了新方向。
01 NSCLC TILs中分离新抗原反应性T细胞
为了确定新抗原反应性T细胞表达的TCR序列，作者首先在白细胞介素-2的作用下体外扩增了来自四个患者样本的NSCLC TILs。并对患者新鲜肿瘤样本和匹配的外周血样本进行了全外显子组测序（WES）分析，以确定非同义的基因突变。通过筛选WES，作者共发现了514个突变肽和39个编码突变的串联基因（TMG），确定了11个突变反应TCR（7个来自CD8+，4个来自CD4+T细胞），并通过 IFN-g分泌试验确认了它们的新抗原特异性。TMGs在体外转录，通过电穿孔将RNA导入自体树突状细胞，使这些树突状细胞作为肿瘤细胞的替代物，与扩增的TILs共同培养。最后用荧光激活细胞分选(FACS)对活化的T细胞进行分选和TCR-CITE-seq测序分析。
02 高频TCR克隆型与CD39+CXCL13+共表达可前瞻性地识别新抗原反应型CD8+T细胞
接下来，作者比较每位病人肿瘤特异性CD8+T细胞与其他CD8+T细胞在蛋白质和基因水平的异同。作者发现，在未培养的TILs中，CD39-细胞的克隆型频率普遍高于CD39+细胞，而且绝大多数CD39-T细胞不表达CXCL13，但表达高水平CXCL13的细胞普遍都表达CD39蛋白。然后，作者选择使用CD39+ CXCL13+亚群中频率最高的T细胞克隆型和CD39-亚群中的高频克隆型来生成编码相关应答TCR的逆转录病毒构建体，并评估了它们与从WES中鉴定出的候选新抗原的反应性。作者发现从CD39+ T细胞中分离出的33个具有未知反应性的TCR中有15个具有新抗原反应性，且从CD39-T细胞中分离出的21个TCR中没有一个具有新抗原反应性。
03 CD39+CXCL13+识别CD4+新抗原反应T细胞
由于传统的TIL筛选方法发现的CD4+新抗原反应T细胞数量很少，因此作者无法独立为CD4+新抗原反应TIL建立表型特征。遵循上文中CD8+新抗原反应性TIL的方法，作者评估了在t-SNE图中与已知新抗原反应性的少数CD4+TIL共同聚类的TIL。将1600个CD4+T细胞的表达谱与映射在该细胞群之外的所有15,207个CD4+T细胞的表达谱进行比较，发现表达CD39蛋白、TIGIT和CXCL13的T细胞在该细胞群中高度富集。CD39+群体几乎包含了所有的TIGIT+T细胞，这个CD39+ TIGIT+群体又可细分为FOXP3+ Tregs和FOXP3- CXCL13+细胞，而后者包含了所有的新抗原反应克隆型。
结论和意义
该研究中，作者首先筛选了体外扩增的NSCLC TIL，以确定新抗原反应性T细胞，并对其TCR可变区进行了测序。同时，对同一患者的新鲜NSCLC TIL进行了单细胞免疫组库（scTCR-seq）和表位测序（CITE-seq），重点研究含有新抗原反应T细胞CDR3区域的克隆型。通过这项分析，作者建立了新鲜肿瘤中新抗原反应T细胞的特征，并鉴定出了更多HLA I类和II类受限的新抗原反应TCR。以上研究内容为开发简化癌症免疫疗法中的应用提供了动力。
参考文献：
Hanada KI, Zhao C, Gil-Hoyos R, Gartner JJ, Chow-Parmer C, Lowery FJ, Krishna S, Prickett TD, Kivitz S, Parkhurst MR, Wong N, Rae Z, Kelly MC, Goff SL, Robbins PF, Rosenberg SA, Yang JC. A phenotypic signature that identifies neoantigen-reactive T cells in fresh human lung cancers. Cancer Cell. 2022 May 9;40(5):479-493.e6. doi: 10.1016/j.ccell.2022.03.012. Epub 2022 Apr 21. PMID: 35452604; PMCID: PMC9196205.
