大片段载体的分段构建

我们在构建一些大的基因片段时，由于基因片段过大，会导致单纯做PCR扩增时没法扩增出全长来。因此需要对基因做分段，PCR处理，这种情况有两种常用方法，一种是纯PCR，另一种是分段PCR后连接。在这里主要介绍分段+酶切的方法。

一.分段PCR+酶切法

原理：酶切位点1-A片段-酶切位点2-B片段-酶切位点3-C片段-酶切位点4。

其中，“A片段-酶切位点2-B片段-酶切位点3-C片段”这一段是目的序列，

酶切位点1-和-酶切位点4是为了能和bacbone相连，而引入的两个粘性末端。

优点：可操作性强

缺点：目的基因上的酶切位点必须与载体上的酶切位点的顺序一致，不是所有的基因都适用

下面是具体操作

1.查看目的基因（insert）上已有的酶切位点

这里以答主做的AFAP1-AS1基因为例(主要是一开始直接PCR，没扩出来，郁闷)，用的软件是snapgene，具体软件的操作可另外搜寻。

AFAP1-AS1基因上的酶切位点

2.查看所用载体（backbone）的酶切位点

这里使用慢病毒载体plvx-puro

载体plvx-puro上的酶切位点

3.对两者的位点做比对

需要注意顺序，骨架上的酶切位点顺序要和目的基因上酶切位点的顺序一致!!!

这里按照载体backbone上的酶切位点顺序进行比对。

XhoI：无

BstBl：无

EcoRI：在insert的881bp处

Apal：在insert的91bp处

BamHI：在insert的6658bp处

XbaI：无

在这次比对中，Apal这个位点的顺序不对，因此不做考虑。

因此，理论上来说，可以分成（XhoI或BstBl）1-881（EcoRI）882-6658（BamHI）6657-6810（XbaI）。但是其中的最长片段依然达到了6kb左右，做直接扩增那一片段依然有困难，因此不做考虑。