CAR-T细胞治疗：当前的挑战和优化策略
嵌合抗原受体 T 细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫疗法是指通过对人体T细胞进行工程化改造，使 T 细胞可以特异性靶向清除肿瘤细胞，从而达到精准治疗癌症的目的。
2021年6月22日，中国首个CAR-T细胞治疗产品阿基仑赛注射液（奕凯达）获批上市，无论是作为中国首个上市的细胞药，还是120万的价格，均成为大众热议的焦点。
那么到现在一年多时间，究竟有多少国人接受到了CAR-T的治疗呢？依据复星凯特的公告：“在正式上市后的一年来，奕凯达适用于治疗既往接受二线或以上系统性治疗后复发/难治性大B细胞淋巴瘤，已经治疗了超过200位中国患者”。
而去年上市的另外一款CAR-T细胞产品倍诺达（瑞基奥仑赛注射液），来自药明巨诺，销售价格为129万元，药明巨诺披露“截至2022年6月10日，药明巨诺的细胞免疫治疗药物已成功完成234位中国患者的回输治疗。”
从这个临床治疗案例数量来看，可见CAR-T治疗在中国的推广任重道远。虽然一个重要原因是价格高昂非一般家庭能够承受，但是我们认为根本原因还在于CAR-T免疫疗法尚不完善，在临床治疗上仍存在许多问题，如对肿瘤识别特异性不强、安全性不高、CAR-T在体内的持久性较差等。
因此接下来我们就全面的解析下CAR-T细胞治疗在当下的挑战和优化策略。
CAR-T发展史
首先我们回顾一下CAR-T技术的发展过程。
1986年Steven Rosenberg报告了一项关于肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的研究，这才让人们意识到“患者自身的免疫细胞可以对抗自身癌症”！
1992年，ZeligEshhar团队利用抗体结合域和T细胞受体上免疫球蛋白的γ或ζ亚单位，通过嵌合单链设计了细胞毒性淋巴细胞的特异性激活，从而开发出第一代CAR-T细胞。
1997年，Sadelain的团队证明，将CD28等共刺激信号整合到CAR-T中可增强生存、增殖并保持活性，从而开发出第二代CAR。随后，携带靶向CD19的CAR-T细胞被开发出来，并启动了慢性淋巴细胞白血病（CLL）和急性淋巴细胞白血病（ALL）的I期临床试验。
2012年，患上急性淋巴细胞白血病的Emily参与了费城医院启动的一项针对儿童B细胞急性淋巴细胞白血病的CAR-T临床试验，3周后，Emily的癌细胞完全消失，10年没有复发。
因此美国开始加速CAR-T细胞药的上市，2017年，美国FDA批准了首款CAR-T细胞疗法上市。到目前为止，FDA批准了六种用于癌症治疗的CAR-T细胞治疗药物。
美国上市CAR-T药品
CAR-T能治疗哪些肿瘤
目前CAR-T的主要领域还主要集中在血液肿瘤，主要用于治疗儿童和青年复发/难治性急性B细胞淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）和成人特定类型的B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL）。
包括复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、复发/难治性套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）和复发/难治性滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）等。
随着大量有关CAR-T临床研究的开展，针对不同靶点的有关CAR-T细胞还有望应用于B-NHL、多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）、慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）、急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）、T细胞淋巴瘤及实体瘤等领域。
各种血液恶性肿瘤的可能治疗靶点
CAR-T的四代技术
CAR-T 免疫疗法中 CAR 的设计是关键，CAR 是融合了可以特异性识别抗原的单克隆抗体的单链可变片段（single-chain variablefragments，scFvs），包含可变重链区（variable heavy，VH）和可变轻链区（variable light，VL）与 T 细胞受体（T cell receptor，TCR）的胞内信号传导域，且表达CAR的T细胞不受 MHC 限制。
目前 CAR 已经发展到第四代。第一代 CAR 的 scFv 只整合了 CD3ζ信号域，可以引发肿瘤特异性细胞毒性。部分第一代 CAR-T 细胞显示出长期持久性，但是扩增有限且不能诱导有意义的抗肿瘤作用。
第二代、第三代 CAR 在 CD3ζ 上游整合了 1 个或 2 个共刺激性结构域（通常是 CD28 或 4-1BB），赋予了 T 细胞更有效的抗肿瘤细胞作用，同时增加细胞因子的产生，并改善了 CAR-T 细胞的增殖和持久性。
第四代CAR被称为“装甲CAR”。装甲 ，即赋予CAR-T一个装备，使其更强大。在第二代、第三代CAR 基础上又整合了其他刺激性结构域，共表达一些关键的细胞因子或共刺激配体，旨在修饰肿瘤微环境，如炎性细胞因子 IL-12、IL-1或 CD40L分泌，以增强抗原交叉呈递并促进表位扩散。
四代CAR-T的不同结构
纵观这四代CAR，第一代抗肿瘤作用弱，第三、四代虽然T细胞对肿瘤杀伤能力增强但给机体带来的毒副作用也随之增加，相较第三、四代而言，第二代 CAR相对温和，在肿瘤治疗中应用更广泛。因此目前全球临床中主要以CD28或4-1BB共刺激域构成的第二代CAR-T为主。CD28或4-1BB共刺激域对促进CAR-T细胞体内增殖和存活具有重要意义，能显著提高接受CAR-T疗法患者的完全缓解率。
CAR-T 细胞疗法面临的挑战
当前 CAR-T 免疫疗法尚未被广泛应用是因为面临三重挑战。
挑战一：克服CAR-T 脱靶问题，提升特异识别能力。
CAR-T 细胞只有对肿瘤表面抗原进行特异性识别，才能确保其仅攻击肿瘤细胞而不对正常组织造成损伤。
然而，多项研究表明肿瘤会通过下调或丢失表面抗原来逃逸免疫系统识别，如用靶向CD19 的 CAR-T 去治疗 B 细胞淋巴瘤后，高达 60%的复发以CD19抗原丢失为特征。
在实体瘤中，因异质性和肿瘤微环境使得 CAR-T一方面很难找到特异性强、安全性高且不易脱靶的治疗靶点，另一方面肿瘤会被肿瘤微环境保护而免受 CAR-T 细胞攻击，这些均导致 CAR-T 在实体瘤中的应用更为艰难。
挑战二：确保CAR-T应用的安全性
CAR-T毒性主要有两类：细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NTX）或CAR-T细胞相关脑病综合征（CRES）。
CRS“细胞因子风暴”是一种全身炎症反应，由大量活化淋巴细胞以及髓系细胞引起广泛的临床症状，包括发热、疲劳、头痛、皮疹、关节痛和肌痛。
CRS是第一次输注CAR-T细胞后几天内发生的最常见的不良反应。严重CRS病例以心动过速、低血压、肺水肿、心功能不全、高热、缺氧、肾损害、肝衰竭、凝血障碍和不可逆器官损害为特征。
细胞因子释放综合征（CRS）发生机制
NTX是CAR-T细胞免疫治疗的另一常见并发症，发生在40%以上的患者中。通常出现在CAR-T细胞输注后的1至3周内，患者表现出各种症状，如困惑、迟钝、震颤、谵妄、找词困难和头痛。
挑战三 ：维持CAR-T细胞在体内的持久力。
尽管CAR-T细胞治疗完全缓解率高，然而大部分获得缓解的患者在几年内表现出疾病复发，B-ALL的复发率从21%到45%不等。
疾病复发的原因是CAR-T细胞耗竭，CAR-T细胞耗竭是一种功能障碍状态，其特征是由于持续的抗原刺激，CAR结构的共刺激域和抑制性受体的表达增加而导致抗原特异性T细胞的缺失。
最新研究发现，c-Jun的功能缺陷是T细胞耗竭的关键所在，c-Jun是调节细胞蛋白质水平的主要基因，其缺陷会导致抑制T细胞活性的蛋白质增加。
CAR-T 技术的优化与改良
增强 CAR 靶向特异性
针对阴性抗原癌细胞的逃逸，可以对scFv进行优化，通常将其设计为靶向两种抗原甚至三种以上抗原，其结合任一抗原都会触发CAR-T的激活。
使用双特异性 CD20/CD19 CAR-T可治疗复发 B 细胞恶性肿瘤患者，Ⅰ期临床结果显示在治疗 28 天后总缓解率达到 82%。
另外已经证明，三特异性CD19-CD20-CD22靶向CAR-T细胞可以在临床前研究快速消除B细胞淋巴瘤，基于BAFF配体的CAR-T细胞同时靶向三种受体，包括BAFF-R、BCMA和TACI。
布尔逻辑和逻辑门常被用来检测 CAR 与多种抗原组合的反应，以寻找到可提高 CAR-T细胞的安全性和抗肿瘤效果的方法。
组合抗原识别：“和”、“和 - 非”、“或”
在实体瘤领域，科学家们也在努力寻找更多特异性靶点，Pule等将GD2作为靶抗原，利用第二代CAR修饰EBV特异性T细胞治疗儿童神经细胞瘤。
接受治疗的11例患者中，6例肿瘤减退或肿瘤细胞坏死。Ahmed等利用HER-2特异性的二代CAR-T治疗HER-2（+）复发转移肉瘤。接受治疗的19例患者中，4例病情稳定，存活时长12 周至14个月。
另外，具有代表性的抗原靶点还包括mesothelin，用于治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌；CEA，用于治疗肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌；MUC-1，用于治疗肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌；GPC3，用于治疗肝癌；EGFRvII，用于治疗神经胶质瘤、头颈部肿瘤；PSMA，用于前列腺癌等。
增强 CAR-T 疗法安全性
CAR-T治疗相关毒性的预防策略，一方面可以通过CRS和神经毒性的预测性生物标志物来进行检测，通过密集的监测及时做出反应；另一方面是设计更加安全的CAR-T细胞疗法，而目前已经达成共识的策略是给CAR-T装上“安全开关”，在人为可控下进行治疗，且在不良反应发生前及时踩刹车。
目前临床上主要是通过降低CAR-T剂量、使用类固醇疗法或阻断IL-6R的抗体来治疗CRS。
由于IL-6与严重的CRS有关，IL-6通路阻断为CRS的治疗提供了一个良好的选择。Tocilizumab是一种IL-6受体拮抗剂，已被批准由美国FDA批准。
在CAR T细胞患者中治疗CRS的FDA。另一个正在探索的CRS管理策略是阻断IL-1，这是CRS的另一个重要细胞因子的罪魁祸首。IL-1由巨噬细胞产生，参与巨噬细胞的激活途径。
在CRS的动物模型中，通过Anakinra阻断IL-1受体，导致CRS相关的死亡率下降。
CRS临床解決方案
鉴于CAR-T细胞的过度扩增可能导致危及生命的CRS，因此有必要通过增加安全开关来调节CAR-T细胞的扩增和持久性，以减轻意外或严重的毒性。
众所周知的诱导型胱天蛋白酶9 (iCasp9)自杀基因和小分子控制系统已纳入研究，FDA批准的小分子药物充当特异性调节抗原识别或消耗CAR-T细胞的关键开关。
如来那度胺、甲氨蝶呤、阿仑单抗、利妥昔单抗和西妥昔单抗以及正交IL-2，上述单克隆抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)介导CAR-T细胞的耗竭。
增强 CAR-T 细胞的持久性
CAR-T细胞的短期持久性限制了它们的抗肿瘤功效，并可能导致抗原阳性复发。
提高CAR-T细胞持久性的策略有多种，如优化CAR-T细胞结构、利用记忆性T细胞、合理设计CD4/CD8 CAR-T细胞的比例。
迄今为止，CD28和4-1BB是CAR-T细胞产物中最常见的共刺激分子。已经证明，与CD28共刺激相比，4-1BB共刺激可以改善CAR-T细胞衰竭。
值得注意的是，联合CD28和4-1BB可以同时增强抗肿瘤效果并增加CAR-T细胞的持久性。
此外，个性化的CAR设计有助于提升持久性，如CD4+CAR-T细胞表现出优异的持久性，CD4/CD8 CAR-T细胞的比例可能会影响治疗效果，目前1∶1比例的CD4/CD8 CAR-T细胞已被证明具有优异的抗肿瘤效果。
结语
免疫细胞疗法，特别是CAR- T细胞疗法，正被越来越多地使用并纳入治疗癌症的标准做法中。虽然CAR-T细胞治疗还有这上述三大难题有待解决：特异性、安全性及持久性，但是我们相信我们已经走在攻克癌症正确的道路上了。
参考文献：
Zhang X, Zhu L, Zhang H, Chen S, Xiao Y. CAR-T Cell Therapy in Hematological Malignancies: Current Opportunities and Challenges. Front Immunol. 2022;13:927153. Published 2022 Jun 10. doi:10.3389/fimmu.2022.927153
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