ChIP-seq之检峰
ChIP-seq的核心是检峰(Peak Calling),当然现成的工具有很多,其中MACS比较常用,本文以MACS v2为例进行检峰的原理和使用。
一、背景
染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。
多种组学手段二、实验
ChIP实验模式图一、软件下载
著名代码托管网站github上有最新的开发版本: https://github.com/taoliu/MACS
二、软件使用
(1)双峰模型
检峰过程MACS2是基于模型(泊松分布)的方法进行检峰的,上述示意图中的模型是双峰模型,目的是为了将比对上的Reads朝3`端偏移(shift),以更准确地得到蛋白-DNA互作的位置。
这里需要注意对于单端数据(SE)需要进行shift以评估平均插入片段大小(Insert Size);若使用的数据为双端(PE)则直接使用真实的Fragment Size进行检峰。
(2)检峰
单链双峰模型2.1 建立shift模型:
MACS2以固定大小窗口扫描基因组;取前1000个富集程度最好的峰;区分正/负链比对reads,评估d的长度;建立正/负链模型。
2.2 检测显著峰
Reads向中心Shift 1/2d的距离;以长度2d的窗口扫描全基因组得到显著富集的候选峰(基于泊松分布); 合并重叠的峰。
# d:插入片段长度
三、峰型
(1) 窄峰 -转录因子等
专转录因子(2) 混合峰 - 聚合酶II等
聚合酶II(3)宽峰 -组蛋白等
组蛋白四、如何使用
MACS2非常适合转录因子和组蛋白修饰类型的检峰。
使用MACS2时需要根据不同峰型进行参数的调整,软件说明文档参数如下:
常用参数:macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test -q 0.01
宽峰参数:macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam --broad -g hs --broad -cutoff1
其中,-t为ChIP样本;-c为control样本即input;-f为输入文件的格式,一般使用BWA、Bowtie2比对后的BAM文件;-g有效基因组大小,MACS2内置了一些物种如人类是hs;-n为样本名称;-q为检峰显著性阈值; --broad为检测宽峰的阈值; -cutoff为筛选fold-enrichment的阈值。
针对转录因子类型为了得到结合位置的峰顶可以添加 --call-summits,另外--extsize具体数值可以使用macs2 predictd进行评估(例如评估值为200),检峰参数如下:
macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test --call-summits --nomodel --extsize 200 -q 0.01
针对组蛋白类型,需要合并邻近的峰形成宽峰,检峰参数如下:
macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test --broad --nomodel --extsize 173 -cutoff 2 -q 0.01
对于双端数据,-f参数为BAMPE,这时检峰所使用的插入片段长度为实际的平均插入片段长度,不需要建模(使用--nomodel,同时--extsize失效)
检峰之后就是检测基序(motif)了,链接:检测基序
五、其他软件
参考如下文章:
检峰软件比较 检峰精确性比较(NRSF基序)六、参 考
[1] https://www.encodeproject.org/
[2] https://en.wikipedia.org/wiki/ChIP-sequencing
[3] https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/chip-seq.html