2022-06-12

Nat Methods | 多尺度成像获得微米级大脑神经连接图谱

原创 苏安 图灵基因 2022-06-12 15:27 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学技术

撰文：苏安

IF：28.547

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1. 作者建立了一个“混合”开放式光学成像系统，它结合了一个独特的非正交双目标和传统的开顶光片(OTLS)架构，可以用于通用的多尺度体积成像。

2. 作者通过这套光学成像系统，在一个完整的，透明的小鼠大脑组织中展示了对稀疏轴突的有效的筛选和精准的亚微米成像。

3. 这套光学成像系统可以实现高通量自动成像，并且它的开放式架构可以兼容多种功能组合，满足不同的成像需求。

因为视觉光难以穿透生物材料，所以生物组织的显微成像主要发生在二维空间上。但是，生命过程发生在三维组织中，所以三维样本的可视化成为光学成像领域重要的问题。组织中存在的水，蛋白质，脂质等成分会影响3D成像的质量，当前，组织中其他成分的清除技术已经得到快速的发展，推动了3D成像的质量，由于其无与伦比的速度和低光漂白率，光片显微镜已成为透明组织（通过组织清除技术处理过的组织）的高分辨率体积成像的首选手段。虽然光学显微镜在透明组织中应用广泛，但目前的光学显微镜仍存在一些缺点。比如当下的光学显微镜无法同时具备以下特点：①标本的兼容性②兼容当前所有的组织清除方法③不限制标本横向大小④具备深层组织的成像⑤广泛的多尺度成像能力以及成像效率。因此，开发在几微米分辨率下快速筛选大的（厘米尺度）组织体积的能力，以及在亚微米分辨率下量化局部感兴趣区域（毫米尺度区域）内的精细结构的光学显微镜，将是很有价值的。

近期，在Nature methods杂志上发表了一篇名为“A hybrid open-top light-sheet microscope for versatile multi-scale imaging of cleared tissues”的文章，作者建立了一种混合开顶光学薄片显微镜，它使用了一种独特的多物镜配置，安装在一个开顶结构中，允许多用途的3D成像。

大多数透明组织显微镜使用一个面向标本水平面的照明物镜，以及一个与照明物镜正交的收集物镜，即一个正交双物镜(ODO)配置（图1a）。这种成像几何形状对标本的横向尺寸施加了物理限制，因此不可能成像大的、厘米级的组织板。作者开发了具有反向几何形状的ODO系统，通过倾斜两个目标并将其置于样品的上方或下方，克服了这些限制(图1b)。在这个系统中，照明光束和收集光束共享一个物镜，并且彼此非正交，需要一种方法来校正成像平面(图1c)。作者开发了光片theta显微镜(LSTM)(图1d)，它也具有非正交的配置。在LSTM中，高NA收集物镜面向垂直方向（类似于单物镜显微镜），但一对单独的角度物镜用于低NA光片照明。作者的混合显微镜结构包括三个位于标本下方的物镜。其中一个物镜用于光片照明，另外两个物镜用于正交双物镜(ODO)和非正交双物镜(NODO)成像。通过使用电动平台，可以在12×7.5×1cm(XYZ)的大成像体积上进行平铺成像，可容纳多个完整的透明器官和安装在标本支架阵列中的大组织（图1e-f）。ODO和NODO路径可以在0.5-10.7μm的可调横向分辨率范围内成像，成像速度为5mm3~10cm3/h（图1g）。在当前的显微镜配置中，NODO路径提供了0.45±0.07、0.46±0.05和2.91±0.31μm的成像精度，ODO路径提供了4.41±0.83、4.09±1.07和5.48±1.08μm的成像精度(图1h)。下图中提供了用全脑动脉（αSMA）和核（SYTOX-G）染色标记的立方清除小鼠大脑的代表性成像（图1i-k）。图1.混合OTLS显微镜

为了验证OTLS显微镜的成像效果以及成像效率，作者利用ODO成像路径，以4μm分辨率在1小时内快速筛选小鼠大脑，下图显示了全脑范围的轴突投射(图2a，b)。通过中脑检查xy和xz平面上密集的轴突投射，证实了该系统能够在整个完整的大脑中提供4-5μm分辨率(图2c)。然后，在皮层锥体神经元周围的一个目标感兴趣区域进行更高分辨率的成像，结果表明，以此分辨率可以成功识别单个树突和轴突上的棘和静脉曲张（图2f-h）。重要的是，以0.5×0.5×2.7μm(xyz)分辨率对包含目标神经元的0.5mm3子区域进行成像只需24分钟，就能生成180gb的数据集，大大提高了成像效率。图2.在透明组织中的快速多尺度筛选和精准亚微米成像

为了探究OTLS显微镜在多样本多尺度广泛性成像方面的效果。作者在6只小鼠大脑样本中进行转移性菌落的多尺度成像（图3a）。首先将所有小鼠的大脑置于标准的6孔板中(图3b)，并使用快速ODO成像依次进行筛选(图3c)。成像后，在所有小鼠大脑中以转移菌落为中心的总感兴趣区域(roi)进行手动识别，并在不移动标本的情况下进行顺序成像。图3d显示了每个大脑的ROI示例，对全脑图像的目视检查显示，MDA-MB-231癌细胞的转移性生长表现为血管共选择性(图3e-g)，而OS-RC-2癌细胞的转移则没有。对高分辨率roi进行的体积分段脑转移进行形态学分析，发现两种转移细胞系之间有统计学差异(图3i)。图3.多尺度OTLS显微镜对脑转移瘤的定量分析。

混合开顶光学显微镜的一个明显优势是，可以更有效地执行复杂细节的三维成像，如分子和单细胞，以及在完整和未受损组织中的生物结构（如肿瘤血管系统）的三维成像。该混合仪器能够很好地可视化复杂的物体，如单个神经元树突上的脊柱，以及小鼠大脑深处乳腺癌转移的空间三维分布。最令人惊讶的是，所有这些图像都是用同一个光片显微镜记录下来的。同时，这种技术还可以对整个样本中每个细胞的空间位置和表达谱进行高通量的分析，最高可达数千万个细胞，这项研究成果可以极大推动透明组织三维成像领域的发展。

教授介绍：

Jonathan T. C. Liu

Jonathan T. C. Liu美国华盛顿大学机械工程，生物工程和实验室医学与病理学教授。

2005年获得斯坦福大学机械工程博士，2005-2009年在斯坦福大学电气工程和医学院进行博士后研究，2009-2010成为斯坦福大学医学院讲师，2010-2014成为石溪大学助理教授，目前是斯坦福大学教授。Jonathan Liu是分子生物光子学实验室的主任。该实验室开发光学成像解决方案以改善疾病管理。他们正在开发定制光学切片（3D）显微镜设备和计算分析策略，用于早期癌症检测，精准医学（临床决策支持）和手术指导。

参考文献：

Glaser, A.K., Bishop, K.W., Barner, L.A. et al. A hybrid open-top light-sheet microscope for versatile multi-scale imaging of cleared tissues. Nat Methods 19, 613-619 (2022).