细胞培养及转染Protocol
实验一：细胞的复苏
一、目的：
掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。
二、原理：
细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
三、步骤：
（一）材料准备：
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仪器：净化工作台、 离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。
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耗材：枪头、 培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。
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试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）。
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其他物品：记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。
（二）细胞复苏步骤：
1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，于超净台中打开盖子，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml离心管中（离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基），轻弹混匀。
3.离心， 1 000 rpm，5 min。
4.弃去上清液，轻轻敲打重悬细胞，加入含10%FBS的细胞培养基，轻弹重悬细胞，调整细胞密度，接种培养皿，37℃培养箱静置培养。
5.次日更换一次培养液，继续培养。
4、 注意事项：
1．拿出冻存的细胞后，尽快置于37℃水浴中融化，整个复苏过程要快；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．细胞轻弹混匀，勿反复多次吹打。
实验二：细胞的传代
一、目的：
学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。
二、原理：
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段时期。在一代中，细胞培增3～6 次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100 个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。
细胞接种2～3 天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
三、步骤：
（一）材料准备：
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生长良好的细胞，密度约为90%
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仪器：净化工作台、 离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。
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耗材：枪头、 培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。
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试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶、1×PBS。
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其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。
（二）细胞传代步骤：
1.将长成单层的细胞培养皿（60mm）从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中，吸出瓶内的培养基。
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加入1×PBS 2ml，轻轻旋转培养皿以清洗细胞，吸出弃去1×PBS。
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加入胰蛋白酶0.5ml，静置3-5 分钟。
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静置期间，在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中，加入2倍体积完全培养基（含血清），本次加入1ml 完全培养液，吹打，制成细胞悬液。
5.将细胞悬液吸出置于15ml离心管，1 000 rpm，离心5 min。
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弃去消化液，轻敲离心管底，使细胞初步重悬。
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加入1.5ml完全培养基于细胞中，吹打混匀细胞。
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取出另外两个新的60mm培养皿，每个加入2.5ml完全培养基，原消化皿中也加入2.5ml完全培养基，并做标记。
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将离心管中的细胞悬液0.5ml/皿，梅花式分别滴入三个培养皿中。
10.用枪头吹打细胞若干次，置于二氧化碳培养箱中培养。
一般情况，传代后的细胞在4-6 小时左右就能贴壁，2～4 天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。
5、 注意事项：
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加入1×PBS时尽量贴壁加，不要直接对着细胞，以免将细胞吹开，大片脱落；
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培养基及1×PBS实验前37℃水浴箱预热；
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操作过程严格无菌操作；
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加入胰酶后，可以轻敲培养皿，观察细胞呈流沙状即为消化完成。
实验三：细胞的冻存
一、目的：
学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。
二、原理：
细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，起到了细胞保种作用。另外，为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，均需对进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。
细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。
细胞冻存多采用二甲基亚砜作保护剂，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
三、步骤：
（一）材料准备：
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生长良好的细胞，密度约为90%
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仪器：净化工作台、 离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器、液氮罐。
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耗材：枪头、 培养皿、15ml离心管、冻存管、酒精灯、废液缸、液氮。
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试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶、1×PBS、二甲基亚砜（DMSO）。
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其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。
（二）细胞传代步骤：
（一）细胞冻存
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配制含10%DMSO、20%血清、70%培养基的冻存培养液。
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取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
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去除PBS，加入适量胰蛋白酶消化细胞，消化好后，加入2倍体积完全培养基，吹打，悬起细胞。
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离心1000rpm，5min；
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去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，调节冻存液中细胞的最终密度为1×106/ml ~ 5 ×106/ml；
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将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
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在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者，包好棉花，或直接放入冻存盒，置于-80℃过夜，若采用冻存盒则忽略8中的降温步骤。
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如采用棉花包裹，冻存方法：4℃，30min；-20℃，30min； -80℃，过夜，次日早晨，转移浸入液氮中。
6、 注意事项：
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欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80～90%致密度；
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细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力，在-80度可保存数月；
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注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，避光保存；
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一定注意缓慢降温时间。
实验四 转染
（1） 胰酶消化细胞并计数，接种至100mm培养皿中，使其在转染日密度为60%-70。底面积为100 mm的细胞培养皿,每个皿内最大容量加入24.0μg质粒DNA，用1.5 mL无血清培养基稀释,混合在室温下放置5 min。
(1) 使用1.5ml无血清培养基稀释80μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。在5分钟内同稀释的DNA混合。
(2) 混合稀释的质粒DNA和稀释的LIPOFECTAMINE 2000，室温静置20分钟。
(3) 然后将上述混合物均匀的加入到细胞中。
(4) 在37℃，5％CO2，100%饱和湿度中保温6小时，每个培养皿各加入12ml新鲜含10%FBS的DMEM培养液，继续培养。24小时后用新鲜含10%FBS的DMEM培养液替换原先的旧培养基，继续培养。转染24h后可提RNA，转染48小时后可提蛋白和RNA。
293T细胞培养及转染Protocol
