Nature同期两篇LETTER揭示婴幼儿肠道微生物特征
大家好，本期学霸带你精读Nature杂志于2018年10月25日刊发的第7728期的封面文章。这期封面故事涉及本期的两篇LETTER，题目分别为“Temporal development of the gut microbiome in early childhood fromthe TEDDY study”和“The human gutmicrobiome in early-onset type 1 diabetes from the TEDDY study”。
这两篇研究都是“青少年糖尿病的环境决定因素（The Environmental Determinants of Diabetes in the Young, TEDDY）”研究的一部分，是一项多中心合作项目。其团队收集来自美国的科罗拉多州、乔治亚洲、华盛顿州和欧洲的德国、瑞典、芬兰的903位儿童3-46月龄的纵向粪便标本，通过16S rRNA测序（n= 12,005）和宏基因组测序（n= 10,867）研究婴幼儿的肠道微生物特征及其与1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）的关系。
首先，介绍一下这两篇文章涉及到的一些基本概念。
16SrRNA测序
细菌核糖体RNA（ribosome RNA, rRNA）按沉降系数可以分为5S、16S和23S三种。16S rDNA是16S rRNA对应的基因编码序列。16S rDNA因为其种类少，含量大（约占细菌DNA含量的80%），分子大小适中（约1.5kb），存在于所有的原核生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，是原核生物系统分类研究中的常用分子钟。我们通常所说的16S rRNA测序其实是指16S rDNA测序。
16S rDNA序列包含9个可变区和10个保守区，保守区反映物种间的亲缘关系，可变区反应物种间的差异。16S rRNA测序即是通过对16S rDNA某一可变区（通常是V3-V4区）进行PCR扩增和高通量测序，最后将测序数据与16S rDNA数据库比对，从而研究环境菌落多样性。
宏基因组测序（metagenomics sequencing）
通过对环境样品中全部微生物的总DNA进行高通量测序，研究微生物种群结构、基因功能活性、微生物之间的相互协作关系以及微生物与环境之间的关系，是微生物测序的另一重要方法。
16S rRNA测序与宏基因组测序的不同之处主要在于：1）测序原理不同。前者通过对16SrDNA序列的某一段可变区序列进行特异性PCR扩增测序；后者则将微生物基因组DNA随机打断成500bp左右的小片段，通过在片段两端加入通用引物进行PCR扩增测序，再将小片段组织拼接成较长的序列。2）研究目的不同。前者主要研究群落的物种组成、多样性和物种间的进化关系；后者在前者的基础上还可以进行基因和功能层面的深入研究。3）物种鉴定深度不同：16S rRNA测序鉴定微生物常常无法区分到种水平，而宏基因组测序则能区分到种水平甚至菌株水平。
OTU（Operational Taxonomic Units，注意不要写成OUT了哦）
中文翻译为“操作分类单元”，是人为设定的一个标志，通过比较可变区序列，将相似度大于97%的聚为一类，称为同一个OTU。每个OTU对应一个不同的16S rRNA序列，即对应一种不同的微生物种类。
Alpha多样性
指一个特定区域或生态系统内物种的多样性，是反映群落丰富度和多样性的综合指标。群落丰富度（Community richness）是指微生物种类的数目，其评价指数主要包括Chao1指数和ACE指数，Chao1和ACE指数越大，代表物种丰富度越高。群落多样性（Communitydiversity）是指群落中个体分配上的均匀性，其评估指数包括Shannon指数和Simpson指数。Shannon指数越高，表明群落的多样性越高；Simpson 指数值越大，说明群落多样性越低。
Beta多样性
用于不同生态系统之间多样性的比较，也就是样品间的差异。alpha多样性只是评估生态环境内物种的多样性程度，不侧重于比较，而beta多样性侧重于对不同生态系统的多样性进行比较，其常用的分析方法有：主成分分析（principal component analysis, PCA）、主坐标分析（principal coordinatesanalysis, PCoA）、非度量多维尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling, NMDS)等。
Bray–Curtis不相似性（Bray–Curtis dissimilarity）
是生态学和生物学中以J. Roger Bray和 John T. Curtis命名的一个统计指标，根据每个生态系统的计数量化两个不同生态系统的组成差异。Bray–Curtis不相似性的取值范围在0-1之间，0代表两个生态系统的物种构成完全相同，1代表两个生态系统的物种构成完全不同。
巢式病例对照研究（Nested Case-Control study，NCC）
又称队列内病例对照研究，是将传统的病例对照研究和队列研究结合形成的一种新的研究方法，其研究思路为：1）建立队列：按照队列研究的方法选建立队列，收集研究对象的基线资料，并留存生物学样本备用（如血清、粪便等），然后开始进行随访；2）确定病例和对照：随访结束后，将新发的病例全部挑选出来，作为病例组，然后按照1:1或1:n的比例在同一队列人群中匹配对照组；3）提取信息进行分析：提取病例组和对照组的基线资料，并检测留存的生物学样本，按照病例-对照研究的分析方法进行统计分析。
现在开始介绍正文。
第一篇文章
“Temporal development of the gut microbiome in early childhood fromthe TEDDY study”主要介绍婴幼儿肠道微生物的动态变化特征及影响其变化的因素。作者首先介绍了3-46月龄婴幼儿肠道微生物的物种组成特征，通过Dirichlet multinomial mixtures (DMM)聚类将16S rRNA测序的结果分为10个cluster（见下图），物种的丰富度和多样性随着cluster依次增加。通过使用前五个菌门的混合效应模型和Shannon多样性指数，作者将微生物的进展分为三个不同的时期：发展期（3-14月），过渡期（15-30月），稳定期（≥31月）。在发展期，五个菌门和Shannon多样性指数都发生显著变化，在过渡期只有两个菌门和Shannon指数发生显著变化，而稳定期五个菌门和Shannon指数都基本不变。
接下来作者探究影响菌群变化的显著因素，如下图所示，a、b、c分别为基于16S rRNA测序的微生物属水平、宏基因组测序的微生物种水平和功能宏基因组模块层面的相关性分析，可以看到母乳是与3-14月龄婴儿肠道微生物特征显著相关的一个协变量。
下面两幅图主要展示哺乳与双歧杆菌属的丰富度增加相关，断奶能够促进肠道微生物的快速成熟。
作者还进行了宏基因组的功能聚类分析，如下图，BM代表breast milk，即母乳，可以看到母乳和非母乳的通路聚类可以明显分开，母乳的婴儿与碳水化合物和脂代谢通路、脂肪酸生物合成通路、β氧化和acyl-CoA合成通路明显相关，而非母乳的婴儿代谢通路变化则相反。
第二篇文章
“The human gut microbiome in early-onset type 1 diabetes from theTEDDY study”则主要利用宏基因组的数据，通过巢式病例对照研究的方法研究婴幼儿肠道微生物与T1D和自身免疫性胰岛（islet autoimmunity, IA）的相关性。
作者首先展示物种构成特征，下图a是通过PCoA分析展示beta多样性，可以看到PCoA1和PCoA2因素可以较好地区分大月龄（接近36月龄的蓝色点）和小月龄（接近3月龄的红色点）的样本，其中1岁前的物种构成以双歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）、长双歧杆菌（Bifidobacteriumlongum）、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）和变形杆菌（Proteobacteria）为主。为了比较微生物的稳定性和差异性，作者进一步比较了受试者内、临床中心内和临床中心间的Bray–Curtis不相似性，可以看到临床中心间和临床中心内物种的不一致性逐渐降低，在开始收集样本的初期差异最大。
作者接下来探究了抗生素对婴幼儿肠道微生物构成的影响。如下图所示，c图中绿线代表未服用抗生素，红线代表有服抗生素，可以看到服用抗生素后微生物的差异性明显大于未服抗生素组，作者提示可能由于服用抗生素后导致双歧杆菌丧失其优势地位，导致其它菌属增殖所致。d图展示的是服用抗生素后明显减少的细菌种类，减少倍数最多的是双歧双歧杆菌，而长双歧杆菌、短双歧杆菌减少倍数不是很大。
作者然后进行功能学研究，探究微生物代谢酶的构成随年龄的变化。下图是前15种菌属呈现的前20个最一致的增加或减少的酶，可以看到一些酶随年龄的增加而增加，而另一些酶则减少。
作者进而比较了病例组和对照组微生物的物种构成和功能特征的差异，发现一些与T1D和IA相关的因素，如在T1D的病例-对照研究队列中，作者发现对照组肠道微生物拥有更高水平的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和乳酸乳球菌（Lactococcuslactis），而T1D病例组有更高水平的假双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）等。
病例对照研究中具有最显著差异的通路是与细菌发酵有关的通路，发酵通路水平在TID的对照中明显增加。同时作者观察到健康对照组的短链脂肪酸合成通路明显增加。
最后作者发现母乳喂养的婴儿的肠道微生物以长双歧杆菌为主的某些菌株含有分解母乳寡糖（human milk oligosaccharide, HMG）的基因。下图展示的是长双歧杆菌在喂奶时及断奶后参与HMG利用的一些基因的变化。
终上，两篇文章的套路均是先描述微生物的物种构成（alpha多样性和beta多样性），然后进行功能分析，第一篇文章的侧重点是展示3-46个月婴幼儿肠道微生物的动态变化，16S rRNA测序的数据和宏基因组测序的数据相互印证，并通过相关性分析找出影响婴幼儿肠道微生物变化的相关因素；而第二篇文章则是比较T1DM和IA患者与相应的对照之间具有差异的微生物物种构成和功能特征。
希望本文能给你以启发。
