生信分析丨m6A相关lncRNA结合免疫浸润轻松发6分+2区SC

大家好！今天跟大家分享的文献是2021年7月发表在Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF=6.684）杂志上的一篇文章。作者对TCGA数据库中BRCA患者的RNA-seq数据集及额外的RNA-seq数据集进行分析鉴定与m6A有关的lncRNA。根据单因素和多因素Cox回归分析构建m6A-LPS。该预后模型可用准确预测BRCA患者的预后。

题目：Comprehensive Analysis of the Immune-Oncology Targets and Immune Infiltrates of N6-Methyladenosine-Related Long Noncoding RNA Regulators in Breast Cancer

乳腺癌N6甲基腺苷相关lncRNA调控因子的免疫肿瘤靶点和免疫浸润分析

摘要

乳腺癌是目前发病率最高的癌症之一。为预测乳腺癌的预后，还需要对乳腺癌标志物进行深入研究。本研究中作者对TCGA数据集和RNA-seq数据集使用Pearson相关性分析，单因素和多因素Cox回归分析鉴定可以作为预后标记物的N6-甲基腺苷相关lncRNA（m6A相关lncRNA）。鉴定基于12个lncRNA构建m6A相关lncRNA预后模型（m6A-LPS）。根据风险打分将患者分为高风险组和低风险组，其低风险组免疫打分较高，免疫靶点表达水平上调表达，而高风险组与基因突变情况，Wnt/β-catenin信号和JAK-STAT信号通路相关性更强。此外，基于风险打分和临床特征构建的列线图可以预测BRCA患者的总生存期（OS）。因此，m6A-LPS可以作为预测BRCA患者预后的标志物，对个体免疫治疗具有积极影响。

流程图

结果

1. 数据的获取和整理

从TCGA下载BRCA患者的mRNA表达数据，lncRNA注释文件和临床数据。从RNA-seq数据集中获取lncRNA的注释文件。从以往的研究中获取21个m6A相关基因的表达矩阵。

2. 鉴定BRCA患者中的m6A相关lncRNA

本研究中作者从TCGA数据集中鉴定到16501个lncRNA，从RNA-seq数据集中鉴定到17573个lncRNA。根据lncRNA表达水平与21个m6A相关基因表达水平的相关性鉴定m6A相关lncRNA。图1A为本研究的流程图。根据Pearson相关性鉴定到1509个m6A相关lncRNA。将TCGA数据集（1089例）随机分为训练集（545例）和验证集（544例）。随后进行单因素和多因素Cox回归分析鉴定到12个m6A相关lncRNA与OS有关（图1B和1C）。图1D为m6A相关基因与这12个m6A相关lncRNA的相关性热图。

图1 流程图和单因素及多因素分析

3. 构建和验证m6A-LPS

作者根据这12个m6A相关lncRNA构建预后模型（m6A-LPS）。根据lncRNA计算患者的风险打分。图2A和2B为训练集和验证集患者的风险打分和生存状态分布。热图表明保护性lncRNA的表达水平随风险打分降低而升高，而风险性lncRNA的表达水平随风险打分升高而升高。此外，训练集ROC曲线的AUC为0.722，验证集ROC曲线的AUC为0.698。KM生存分析表明高风险组的OS较差（图2A和2B）。

4. m6A-LPS与免疫细胞浸润和免疫肿瘤靶点的相关性

作者研究高风险组和低风险组的28种免疫细胞比例（图2C），其中高风险组中CD56dim自然杀伤细胞和中性粒细胞浸润水平更高，而低风险组中活化B细胞、效应记忆CD4 T细胞、效应记忆CD8 T细胞、记忆B细胞、1型T辅助细胞、2型T辅助细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞和浆细胞样树突状细胞浸润水平更高。此外，这28种免疫细胞类型与风险打分相关性如图2D所示。两组的免疫打分不同，低风险组的免疫打分更高（图2E）。高风险组的激活B细胞，效应记忆CD4 T细胞和中性粒细胞浸润水平较低（图2F-2H）。为研究免疫肿瘤靶点与m6A-LPS的相关性，作者比较两组中免疫靶点的表达水平差异，CTLA4、PDCD1、CD274和CD19在高风险组中表达水平较低（图3A），这4个靶点与lncRNA的相关性如图3F所示。

图2 风险打分分布图，聚类热图和生存曲线

5. 风险打分与SNP，TMB，基因集富集分析和化疗的相关性分析

对两个分组进行基因突变分析，高风险组中有420个样本发生SNP，其中TP53、PIK3CA和TTN的比例最高（图3B），低风险组中有387个样本发生SNP其中TP53、PIK3CA和CDH1的比例最高（图3C），高风险组中TMB较高（图3D）。此外，GSEA分析表明高风险组与Wnt/β-catenin信号和JAK-STAT信号通路有关（图3E）。随后，作者研究风险打分对BRCA患者化疗作用的预后价值。对BRCA化疗患者分组并进行生存分析，高风险组OS较差（图3G），AUC为0.819（图3H）。

图3 风险打分与SNP，TMB，基因集富集分析和化疗的相关性分析

6. m6A-LPS的分层分析和独立性预后分析

热图表明TGFB2-AS1, LINC01725, AP002478, AL352979, AL033543, ZNF197-AS1, AL592546, AC092653和AP005131的表达水平随风险打分升高而降低，而OTUD6B-AS1, LINC02296和 AC022150的表达水平随风险打分升高而升高，其表达水平也与临床特征有关（图4A）。此外，单因素和多因素Cox回归分析表明m6A-LPS是BRCA患者的独立预后因子（图4B和4C）。ROC曲线表明m6A-LPS的AUC值最高（图4D）。

7. 构建列线图

作者基于风险打分和临床特征构建列线图来评估患者的3.5年、5年和7.5年的生存情况（图4E）。校准曲线表明列线图预测OS的效果较好（图4F）。

图4 m6A-LPS是预后独立因子和列线图

8. m6A-LPS的外部验证和蛋白编码基因分析

作者使用RNA-seq数据作为验证数据集验证m6A-LPS的预后价值。该数据集的低风险组OS优于高风险组，ROC曲线的AUC为0.744（图5A和5B）。此外，图5C为患者的风险打分和生存状态的分布情况以及12个lncRNA的表达水平。此外，作者将蛋白编码基因添加到该预后模型中，其ROC曲线的AUC为0.677，较m6A-LPS的AUC低。总的来说，作者构建的m6A-LPS可以预测BRCA患者预后。

图5 验证数据集

结论

作者对TCGA数据集进行分析构建了一个m6A相关lncRNA的预后模型（m6A-LPS）。根据m6A-LPS可以将BRCA患者分为高风险组和低风险组，两组的生存情况，免疫细胞浸润比例，TMB及基因突变情况均不同。作者使用RNA-seq数据集作为验证集验证m6A-LPS的预后性能。但是本研究还存在一定局限性，例如GEO数据库缺乏可用的lncRNA数据集，无法进一步验证。此外，对m6A相关lncRNA在BRCA患者肿瘤微环境中的调控机制尚不清楚还需要进一步研究。

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