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研究背景：

成神经细胞瘤(NB)是一种临床异质性的儿童交感神经系统肿瘤，占总癌症相关儿童的15%。近年来，多种基因组标记物的鉴定有助于NB患者的风险分层和生存率的提高。发现PARP1基因的常见遗传变异有可能预测高风险NB患者的治疗失败。患者经历化疗耐药或复发的比率仍然很高，临床实践中的替代治疗方案有限;因此，迫切需要制定额外的治疗策略。肿瘤在基因和表型上都不是一个简单的整体结构的细胞，而是由不同的细胞实体组成的更复杂的系统。在同一肿瘤内，细胞可以通过复杂的遗传和翻译后修饰来适应不同的选择性环境压力，从而产生了肿瘤内异质性(ITH)现象。单细胞测序(sc-seq)技术的引入为研究人员提供了一套新的工具来询问ITH和了解肿瘤的起源和组成。应用scRNA-seq来证明培养的细胞系再现了肿瘤中恶性细胞之间观察到的异质性，因此建议将其用于癌症研究。

研究结果：

一、顺铂和依托泊苷处理诱导细胞亚群形成，具有不同的转录组特征

1、对两对NB细胞系进行了单细胞RNA-seq (scRNA-seq): i) UKF-NB-4亲本和UKF-NB-4耐顺铂(UKF-NB-4 CDDP)细胞系和ii) HTLA-230亲本和HTLA-230耐依托泊苷 (HTLA-230 ER)细胞系。

2、通过存活率和克隆试验评估了UFK-NB-4和HTLA-230细胞系对顺铂和依托波苷的耐药诱导。

3、经过数据过滤和归一化，获得了1514个UKF-NB-4 CDDP与2646个UKF-NB-4细胞以及1674个HTLA-230 ER与1160个HTLA-230细胞的转录谱。这些细胞表现出不同的转录组谱。在这两种细胞系中，耐药细胞都与未处理的细胞分开聚集(图1A,B)，这表明药物治疗(顺铂或依泊苷)显著影响了这些细胞系的转录组。

4、通过单细胞转录组谱的异质性分析，在UKF-NB-4中鉴定了3个簇，在UKF-NB-4 CDDP中鉴定了4个簇(图1C)，在HTLA-230中鉴定了4个簇，在HTLA-230ER中鉴定了4个簇(图1D)。

二、耐药影响NB细胞的特性

1、在NB细胞系和肿瘤中，两种表型分化的细胞以肾上腺素能(ADN)细胞和未分化间充质(MES)细胞为主。

2、为了了解NB细胞身份是否参与化疗耐药性，评估了通过scRNA-seq分析获得的细胞簇(CL)中已知ADN和MES特征的富集情况。在UKF-NB-4 CDDP vs UKF-NB-4细胞中，亲本CL0、CL5和CL6簇的MES和ADN基因显著富集(图2A)，但与ADN签名相比，MES签名优先呈现(图2B)。

3、所有顺铂耐药簇均强烈富集ADN基因(图2A和B)。

4、在亲本HTLA-230细胞中，发现所有集群(CL0、CL1、CL3和CL7)都富集ADN基因(图2C)，与MES特征相比，CL3和CL7的表达明显过高(图2D)。

5、而在HTLA-230-ER细胞中，发现所有簇都同样富集MES和ADN基因(图2C, D)，这些结果可能突出了依赖泊苷耐药细胞的可塑性潜力，因此它们能够从MES身份转换，反之亦然。

三、ITH强调药物潜在耐药的发展

1、为了推断与每个聚类相关的生物学特征，使用了Seurat (FDR <0.01)对生物过程的基因本体(GO)数据库进行过度表示分析。然后对结果进行聚类以进行亲和传播。图2E和F绘制了两张热图，汇总了每个聚类中按p值排序的前10个重要生物过程的结果。

2、在UKF-NB-4细胞中，观察到两个亚细胞簇具有显著的生物学过程(FDR <0.01)(图2E): CL0的特征是参与DNA和RNA代谢过程调控的基因通路，CL5的特征是与组织和器官发育相关的通路(如组织迁移、原肠胚形成、干细胞分化等)。

3、在HTLA-230细胞中，所有簇都显示出显著的生物过程富集(图2F)。亚细胞簇CL0的过表达基因参与组织和器官发育(图2F)， CL1和CL3的过表达基因参与DNA和RNA代谢和基因表达过程，而CL7的过表达基因完全参与神经系统发育和组织的生物过程。

四、NB细胞株ITH可预测成神经细胞瘤的预后

1、为了分析大队列NB样本中涉及耐药的组成和生物学程序，使用UKF-NB-4 CDDP vs UFK-NB-4和HTLA-ER vs HTLA-230细胞的scRNA-seq聚类分析中得到的每个聚类的表达签名来分解大量NB肿瘤的转录组。

2、通过这种方法，在NB样本(SEQC队列)中观察到的ITH与UKF-NB-4和HTLA-230细胞系群体中观察到的ITH相当(图3A, B)。

3、事实上，观察到，虽然属于同一细胞群，但不同的群集与不同的阳性或阴性临床因素相关。例如(图3C) CL0和CL5 (UKF NB-4细胞)分别与高风险(HR)-NBs 和低风险(LR)-NBs 相关，而CL2和CL3 (UKF NB4-CDDP细胞)分别与HR-NBs 和LR-NBs 相关。

4、同样(图3C)， CL3(属于HTLA-230细胞)与HR-NBs 相关，CL2和CL5(均属于HTLA-230 ER细胞)分别与LR-NBs和HR-NBs 相关。

5、评估了其他具有预后意义的NB临床参数，如MYCN扩增(图3D)、分期(图3E)和肿瘤发病年龄(图3F)，对于每个CL，评估了在风险比较中观察到的相同临床相关性(图3C)。

6、在UKF-NB-4 CDDP细胞中，CL2与评估的所有最差预后因素相关(图3D,E,F): MYCN扩增， 4期，诊断年龄，突出了更具侵袭性的细胞亚克隆的存在(由于顺铂治疗)，并证实了GO分析中观察到的生物学意义(图2E)。

7、在HTLA-230 ER细胞中，CL5(图3D,E,F)与MYCN扩增、4期和NB发病年龄相关，这表明该细胞亚克隆可能是一个更具侵袭性的克隆(由于依托波苷治疗);事实上，氧化石墨烯分析显示了生物合成和代谢生物过程的丰富。

8、HTLA-230细胞的CL7以表达参与神经系统发育和组织过程的基因为特征(图2F)，与高生存率显著相关，这加强了该CL由分化程度更高、侵袭性更低的细胞组成的假设。

9、与不良临床因素相关的集群CL0 (UFK-NB4)、CL2 (UFK-NB4 CDDP)(图3G)、CL3 (HTLA-230)和CL5 (HTLA-230 ER)(图3H)具有明显的最差预后。

10、CL2(顺铂耐药细胞)和CL5(依赖泊苷耐药细胞)特征在无反应NB患者筛查中可能具有临床意义(图3G,H)。

总结：
在本研究中，研究了目前用于NB患者一线治疗的对依泊苷和顺铂药物耐药的NB细胞系亲本和单细胞水平的转录组谱的变化。
本工作中描述的分析已经证明了单细胞RNA数据在以下方面的实用性:
(1)识别不同的肿瘤细胞群，确定耐药的ITH及其亲本NB细胞;
(2)发现耐药对NB细胞鉴定的影响;
(3)揭示NB细胞系的ITH反映了NB肿瘤的细胞组成。

本研究已经确定了在顺铂或依泊苷治疗期间获得的转录不同的细胞亚群的同时存在，这些亚群聚集在亲本NB细胞之外，强调了ITH现象及其与化疗耐药的联系。此外，还证实了这两种NB耐药细胞系彼此聚集，进一步加强了ITH在NB耐药中的作用。