β-elemene通过m6A甲基转移酶METTL3介导的自噬逆转

前言

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率一直居恶性肿瘤之首。肺癌可分为两种亚型，非小细胞肺癌(non-small cell Lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌。NSCLC可进一步分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌，约占所有肺癌病例的80%。然而，肿瘤治疗的主要手段仍然是手术结合放疗和化疗。尽管越来越多的新型抗癌药物和治疗策略被用于治疗非小细胞肺癌，但它们的疗效仍不令人满意。其中，肿瘤耐药是临床治疗中导致治疗失败和患者死亡的主要原因。因此，克服癌细胞的耐药已成为癌症治疗领域亟待解决的关键问题。

Elemene（榄香烯）是从中药姜黄温郁金中提取的抗癌药物，其主要活性成分是β-elemene。越来越多的证据表明，尽管目前尚无发现其许多作用机制，但在肺癌、白血病、肝癌、宫颈癌和胃癌的治疗中，β-elemene发挥了巨大的生理和病理作用。β-elemene在临床上用于多种肿瘤的放疗增敏和化疗，可有效逆转耐药。有研究表明，β-elemene可以逆转EGFR抑制剂gefitinib（吉非替尼）的获得性耐药，但具体作用机制尚不清楚。

近年来，越来越多的证据表明细胞自噬与癌细胞的耐药密切相关。例如，EGFR-TKIs诱导的高水平自噬对NSCLC细胞的死亡可以起到保护作用。然而，在β-elemene介导的自噬逆转gefitinib耐药中的作用和机制尚不清楚。

研究结果

1. 吉非替尼耐药细胞系的构建及特性分析

作者首先建立相应的吉非替尼耐药细胞系PC9GR和HCC827GR，使用梯度浓度的吉非替尼处理亲代细胞约6个月。为了研究NSCLC亲本细胞系(PC9和HCC827)和吉非替尼耐药细胞系(PC9GR和HCC827GR)的耐药情况，作者检测了一系列细胞功能指标，实验结果显示，抗药细胞的增殖活性显著高于亲本细胞，凋亡率明显低于亲本细胞。同时，免疫印迹结果显示切割的caspase-3和PARP在吉非替尼抗性细胞中的表达明显低于亲本细胞。进一步检测细胞侵袭和迁移能力，发现吉非替尼抗性细胞的迁移能力明显高于亲本细胞。以上结果表明，成功构建了吉非替尼抗性细胞系(PC9GR和HCC827GR)，比亲本细胞具有更强的增殖和迁移能力，对吉非替尼表现出更强的耐受性。

2. β-elemene可逆转非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药性

β-elemene已被用于临床多种肿瘤的放疗增敏和化疗，可有效逆转耐药。因此，作者检测β-elemene能否逆转非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药。克隆形成和凋亡实验显示，β-elemene成功逆转非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的耐药性。为进一步研究β-elemene与吉非替尼联合治疗的疗效，PC9GR移植BALB/c裸鼠建立非小细胞肺癌动物模型，观察β-elemene和吉非替尼的抗癌作用。结果显示，相对于单用的β-elemene或吉非替尼，β-elemene和吉非替尼联用表现出协同抗肿瘤活性。体内和体外的这些结果表明，β-elemene可以逆转非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的耐药性。接着，为探讨β-elemene逆转吉非替尼耐药的可能机制，通过iTARQ测序分析β-elemene与吉非替尼处理后蛋白表达的差异。测序结果显示，与吉非替尼单独处理相比，β-elemene和吉非替尼联合处理后，SQSTM1的蛋白表达显著升高，提示自噬可能参与了吉非替尼抗性的逆转。

3. β-elemene通过抑制自噬逆转非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的耐药

作者基于已有的研究结果以及自噬在肿瘤耐药过程中发挥重要作用，推测β-elemene可能通过自噬途径逆转非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的耐药。由于无血清培养基通常用于诱导自噬，因此作者采用流式细胞术研究有无血清培养基中细胞对β-elemene的敏感性。实验结果发现，在无或低浓度处理下，无血清培养基中细胞凋亡率低于含血清培养基中细胞凋亡率，而高浓度的β-elemene处理则有相反的结果，提示无血清条件下可诱导细胞自噬，保护细胞免于凋亡，β-elemene可明显抑制自噬过程。随后，通过联合使用自噬抑制剂或敲降自噬通路蛋白，进一步说明β-elemene可通过抑制自噬降低吉非替尼耐药细胞的生存能力。为探讨β-elemene调控自噬的机制，采用免疫印迹实验检测自噬通路蛋白表达水平，与氯喹（CQ）的结果相似，β-elemene处理后LC3B-II和SQSTM1的蛋白表达显著增加，尤其是在β-elemene和吉非替尼联合处理的情况下。综合以上结果表明，β-elemene可以逆转吉非替尼的耐药，而自噬在吉非替尼耐药过程中起着至关重要的作用，可以保护耐药细胞免于死亡。

4. β-elemene阻断NSCLC细胞自噬流

先前的结果表明，β-elemene以类似氯喹的方式抑制自噬。接下来，作者构建GFP-RFP-LC3质粒，转染细胞研究自噬流。激光扫描共聚焦显微镜结果显示，相比与对照组，氯喹或β-elemene处理的细胞中，绿色的荧光颗粒含量显著增加，联合处理的时候更为明显。绿色荧光颗粒对溶酶体腔内的酸性条件敏感，红色荧光颗粒表示酸性自噬溶酶体，黄色荧光颗粒表示GFP和RFP的共定位荧光，代表与酸性溶酶体融合前的自噬体。这表明，β-elemene只能增加自噬体，而不能增加自噬溶酶体，这与经典的自噬通量阻断剂氯喹非常相似，透射电镜得到了类似的结果。已有报道，氯喹通过提高溶酶体的pH值来阻止自噬体成熟为自噬溶酶体，并最终抑制自噬体和溶酶体之间的融合。作者推测β-elemene可能通过抑制溶酶体的酸化来抑制自噬，为了证明这一推测，作者使用lyso-tracker红色染料，用于鉴别酸化的囊泡腔室（用于检测溶酶体的酸化）。结果显示，红色荧光颗粒的数量随着β-elemene或氯喹浓度的增加而减少，而红色荧光颗粒的数量正表明溶酶体酸化程度。随后，作者在动物体内评估了β-elemene和氯喹对肿瘤细胞生长的影响。与细胞实验一致，结果显示，与对照或单独用药相比，β-elemene和氯喹联合治疗后肿瘤的平均大小明显减小。综合体外和体内的实验结果，表明β-elemene在NSCLC中可以通过类似氯喹的方式抑制自噬来逆转吉非替尼的耐药。

5. M6A甲基转移酶METTL3参与调节细胞自噬

越来越多的文章报道了m6A甲基化修饰在肿瘤发生和肿瘤发展中起着关键作用，包括细胞自噬和肿瘤耐药。为了探究m6A甲基化修饰在逆转吉非替尼耐药过程中的作用机制，作者进一步研究了β-elemene和吉非替尼对吉非替尼耐药细胞中m6A甲基化修饰的影响。结果显示，β-elemene和吉非替尼显著降低NSCLC耐药细胞中m6A甲基化水平，提示m6A甲基化修饰可能参与了吉非替尼耐药逆转过程。免疫印迹实验结果进一步显示，β-elemene显著抑制了甲基转移酶METTL3的表达，并呈剂量依赖性，但对Virilizer、METTL14、WTAP等甲基转移酶的表达无明显影响。为了进一步预测β-elemene在METTL3中最可能的靶域，我们使用了在线PDB和PubChem数据库以及AutoDock工具软件。经预测，β-elemene可直接结合并靶向于METTL3的S-腺苷腺苷甲硫氨酸结合域。同时，作者利用TCGA数据库分析了METTL3在正常组织和肺腺癌组织中的蛋白表达差异，发现METTL3在肺腺癌患者中表达显著增高。随后，通过在吉非替尼耐药细胞中敲降METTL3的表达，检测METTL3在自噬通路中的调控作用。qRT-PCR实验结果显示，敲除METTL3可显著降低LC3B、ATG5和ATG7的mRNA表达而增加SQSTM1的mRNA表达，免疫印迹实验也有类似的结果。综上所述，这些结果表明，β-elemene可以通过抑制METTL3介导的自噬来逆转非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的抗性。在自噬过程中，METTL3通过上调LC3B、ATG5和ATG7的表达正向调控自噬。

总结

在本研究中，作者确定了β-elemene在体外和体内逆转吉非替尼在非小细胞肺癌中的耐药作用。机制上，β-elemene以氯喹的方式抑制自噬的后期过程，通过阻止溶酶体的酸化，抑制自噬体成熟为自噬溶酶体，从而逆转吉非替尼的耐药性。令人惊讶的是，m6A甲基化修饰参与了这个逆转过程，METTL3可以通过靶向ATG5、ATG7、LC3B和SQSTM1来正向调控这一自噬过程。