VCF format

一、VCF格式背景

1、VCF的由来

• VCF（Variant Call Format）格式是记录测序结果里相对于参考序列的序列变异情况；
• 一般用比对结果产生的bam文件作为输入，利用GATK等variant calling软件，以及参考基因组等数据综合分析最终产生VCF结果

2、基因组变异类型

如下图一般可分为三大类变异

（1）SNP

• single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性
• 指一种碱基变为另一种碱基

SNP&INDEL

（2）INDEL

• 指insert 插入& deletion删除 两种变异类型
• INDEL发生变异的序列长度一般小于50bp

（3）SV

• Structural Variant 结构变异
• 这种涉及的类型比较多，变异程度较高，例如长片段序列的插入/删除，染色体倒位，拷贝数变异

三种变异类型

3、VCF记录变异的示例

• 如下图3条reads在同一参考序列附近的比对结果

  
  image.png
  

  相比ref序列（1）第一行记录：染色体20的第三位发生了SNP变异(C→G)；
  （2）第二行记录：染色体20的第三位的C被删除（INDEL）；
  （3）第三行记录：染色体20的第三、四位之间插入了一个核苷酸A（INDEL）

• 如下图，则为对应上图比对结果的VCF的简要记录格式

image.png

• 当然，VCF格式记录是非常全面的（程度可以类比sam格式）。

  
  VCF format

二、VCF格式总结

• VCF内容分为两大部分，第一部分是以##为标志的注释信息，第二部分则是对变异结果的全面记录。将直接从第二部分开始介绍，涉及到第一部分的注释会进行补充。
• 变异记录部分的第一行为以#为开头的表头部分，就是列名
  image.png

第1列、CHROM

• 即在哪条染色体发生的该行记录的基因变异；

• 染色体名一般与注释部分的config条目结果一致，其中常见的ID与length两个flag分别指代染色体名与长度。

  
  VCF，config

第2列、POS

• 指在染色体序列的什么位置发生了该变异；
• 具体则是表示第4列 REF列记录的第一个碱基的位置，可参考上面那个小例子。
• VCF的变异记录就是分别按第一、二列进行排序；

第3列、ID

• 这一列表示在该染色体的该位置，发生该种变异是否在已有的变异数据库(在variant calling时提供)中有记录。
• 若有，则该列的值就是对应的变异ID；若没有（novel variant，觉得是大部分情况），则就用点号.代替
  前5列

第4列、REF

• 表示在参考序列的碱基，即variant calling的标准；
• 对于SNP，很容易理解，就是变化的那个碱基(核苷酸)；
• 对于INDEL，REF的第一个碱基往往不是发生变异的那个碱基，可参考下图理解
• 在注释部分的##reference条目说明了参考序列来源
  image.png

第5列、ALT

• alternate base(s)，说明相较于ref，具体发生了什么改变
• 对于同一染色体的同一位置可能发生多种变异（尤其是对于多个样本的结果）时，用逗号,分隔；具体可参考上面两张图。
• 对于SNP与INDEL的变异记录(较短序列)还比较容易理解，但是对于Structural Variant的结构变异（一般涉及较长序列）记录比较特殊，如下图所示（example：第二行变异记录表示An imprecise deletion of approximately 205 bp.）
  image.png
  （1）首先，ALT列用注释信息的Flag标签说明SV类型
  SV 注释信息
  SV types
  （2）然后在INFO列(第8列)补充SV变异的具体信息
  SVTYPE即SV类型；END表示SV的变异结束位置；SVLEN表示SV变异的序列长度；由于变异序列信息较长，起始位置估计可能不准确，CIPOS与CIEND分别表示起始位置的置信区间。
  SV 注释信息

第6列、Quality

• 表示对该行variant calling结果为wrong的可能性（错误率）大小；
• 值类似fastq的比对质量分数经过-log10转换；即该列的值越大，表示这一行变异记录越可信。
  image.png

第7列、FILTER

• 这一列是基于第六列错误率以及其它角度对变异结果的可靠性评价；
• 若为PASS则表明符合一定过滤条件的质量合格的变异；若为.或者一些flag值则表明未通过筛选。常见的flag注释有q10、s50等。
  image.png

If filters have not been applied, then this field should be set to the missing value.即全为点.

第8列、INFO

• 补充additional information

  
  image.png

• flag值的含义可在注释信息里找到

  
  image.png
• 常见的有以下四个
  AC：allele count in genotypes，表示在变异的genotypes中，涉及到几个等位基因（对于人等二倍体生物，一般只有两个等位基因）；
  AN： total number of alleles in called genotypes（二倍体AN=2）；
  AF： allele frequency for each ALT allele。简单理解就是AC/AN；
  DP：combined depth across samples；即所有样本里发生该变异的read数目。

对于第5列ALT列有2种的，则AC、AF值也分别有两种。其它INFO的flag就不一一介绍了，其中FS、ReadPosRandSum、MQRankSum等是重要的过滤vcf的标准，之后可重点关注下。

第9+列、FORMAT

• If genotype information is present, then the same types of data must be present for all samples

• 即记录了每个样本的变异genotype信息

  
  image.png
• 首先是FORMAT列写出了以冒号分隔的genotype相关flag值，具体含义可参看注释部分
  image.png
  如上两图，常见的有
  （1）GT：即表示genotype，就是该样本等位基因发生变异的情况，有如下几种取值（是我个人的理解，如有错误敬请指出）
  0|0可以理解为该sample在位点的reads均与ref一致；
  0|1或者1|0表示该sample在位点的一部分reads为REF类型，一部分为ALT类型；
  1|1表示sample在该位点的所有reads均为ALT类型；
  1|2则表示sample在该位点的一部分reads为第一种ALT类型；另一部分reads1位第二种类型。

The allele values are 0 for the reference allele (what is in the REF field), 1 for the first allele listed in ALT, 2 for the second allele list in ALT and so on.
对于|与\的区别， 官方介绍前者表示genotype phased，后者表示genotype unphased。目前我也还没完全理解，参考https://blog.csdn.net/samhuairen/article/details/70243930，https://www.biostars.org/p/5298/

image.png

（2）AD：allele depths，表示sample中该位点里不同allele的覆盖度，一般有两个，逗号分隔，分别表示REF(0)、ALT(1)的覆盖度。如果ALT有两种可能，则就有三个值。
（3）DP：表示sample中该位点的总覆盖度，一般为AD所有值的和。
（4）GQ：Genotype的质量值，类似第6列的含义，不过这里是针对每个样本的计算。
（5）PL：genotype likelihoods，指定的三种基因型（0/0，0/1，1/1）的质量值（provieds the likelihoods of the given genotypes）；这三种基因型的原始概率总和为1，再经过-log10转换。值得注意就是该值越大，表明为该种基因型的可能性越小。所以最有可能的genotype的值为0（参考下图）。

image.png

参考文档链接
1、基因组变异检测概述http://www.360doc.com/content/18/1213/11/52645714_801492183.shtml
2、The Variant Call Format (VCF) Version 4.2 Specification https://github.com/samtools/hts-specs
3、VCF格式的学习及对VCF文件的统计https://www.jianshu.com/p/38f734ae47f5
PS：部分图片来自网上，侵删~