28. GPCR的磷酸化
10.1前言
GPCRs约占哺乳动物基因组的1%，由约1000个基因编码。它们参与调节很多的生物反应。结合激动剂激活后，反应被受体磷酸化关闭(脱敏)。经典地说法是GPCR磷酸化与受体内化和转运有关，涉及到第二信使调节蛋白激酶，如蛋白激酶C和蛋白激酶A，以及G蛋白偶联受体激酶(GRK)家族的受体特异性激酶。最近，GPCR磷酸化也被证明可以介导受体与各种信号通路的偶联，如丝裂原活化蛋白激酶途径。此外，我们实验室最近的研究表明，GPCRs可以被多种激酶家族(不仅仅是GRK家族)以激动剂依赖的方式磷酸化，而特定激酶对受体的磷酸化决定了特定的信号转导结果。
传统研究中，GPCRs磷酸化通常需要纯化受体，但这很难，因为受体的含量通常很低，很难溶解。使用受体特异性抗体进行免疫沉淀已经克服了这个问题。本章介绍了在我们实验室成功应用于m3-毒蕈碱受体磷酸化研究的方法。研究内容包括表位标记受体和受体选择性抗体的制备，以及使用[32P]正磷酸盐放射性标记细胞、受体的免疫沉淀以及随后通过2D磷酸肽图谱分析受体磷酸化特征。还将讨论磷酸氨基酸(PAA)分析和分离磷酸肽的Edman降解，这些揭示并直接鉴定GPCR磷酸化位点的方法。尽管这些方法使用m3受体的例子来说明目的，但它们可以很容易地适用于大多数其他的GPCRs。
10.2.1 抗受体抗体在免疫沉淀反应的应用
10.2.1.1表位标记受体
任何蛋白质，尤其是GPCRs，免疫沉淀成功的关键是抗体的质量。GPCRs通常在SDS -PAGE凝胶上低水平表达并呈宽条带。生产GPCRs抗血清是困难的，十分耗时，而且是一个相当偶然的过程。现在已经有一些商用的受体特异性抗体；其中一些可能很棒，但其他的可能完全不够。为了规避对受体特异性抗体的需求，许多实验室使用重组cDNA技术在受体的N-端或c -端添加一个表位标签。然后，除了用于免疫细胞化学外，商用抗体还有可用于针对标记的免疫沉淀或免疫印迹受体。
许多不同的表位标签可以被工程化成重组受体；最常用的是HA、Flag、His、c-Myc、VSV-G、V5和HSV等等。
在免疫沉淀研究中，我们成功地使用了由Hawtin生成的ha标记的V1a加压素受体，确定了该受体的磷酸化状态。在这些实验中，使用商用的小鼠单克隆抗ha抗体(12CA5, Roche)免疫沉淀受体。
10.2.1.2受体特异性抗体的产生和纯化
然而，抗原表位标签似乎是一个快速解决缺乏高质量受体特异性抗体的问题，但仍有很多不足。首先，添加标记N-或c -末端可能会影响受体的加工、运输或信号特性。第二，研究者仅限于研究质粒转染或病毒感染所表达的重组受体。在原代细胞培养或组织制剂中不可能研究天然受体。这些问题可以通过提高受体特异性抗体来解决。
方案10.1基于我们针对小鼠M3-muscarinic受体第三细胞内环S344-L462区域提出的抗血清。将该区域克隆成细菌表达质粒，生成N端标记的GST受体融合蛋白，用于接种新西兰白兔(HarlanSera-Lab)。在免疫沉淀研究中对产生的抗血清进行了测试，结果显示其可与小鼠m3-毒蕈碱受体特异性反应。
10.2.1.3受体抗体免疫沉淀验证
受体抗体可用于western blots中确定特异性，也可用于免疫沉淀。为了验证免疫沉淀中的抗体特异性，我们建议先对所有细胞表面蛋白进行生物素化，然后制备细胞裂解液，使用受体特异性的抗血清免疫沉淀受体。然后根据方案10.2中所述，使用链霉亲和素偶联辣根过氧化物酶检测受体。
10.2.2 检测[32P]正磷酸盐标记细胞磷酸化受体
我们已经在转染的细胞系和天然组织(特别是小脑颗粒神经元)上进行了许多实验，在这些细胞中，M3-muscarinic受体是由带有[32P]-正磷酸盐标记的细胞免疫沉淀而来的。方案10.3描述了这一过程，有三个简单的步骤：(i)细胞的放射标记，(ii)受体的溶解和免疫沉淀，(iii)通过SDS-PAGE解析受体。
10.2.3用生化方法分析[32P]标记的GPCRs
尽管质谱技术目前已被成功应用于鉴定GPCRs的磷酸化位点，但这受到此类分析所需材料数量的限制。在方案10.4中，我们使用生化技术，而不是限制物质的数量，限制的数量的放射性标签纳入受体。因此，如果受体被很好地标记，即使受体蛋白的实际摩尔量极小，那么这里所描述的磷酸肽映射、Edman降解和磷酸氨基酸也分析可以进行。工作方案可以揭示大量的信息，可以直接确定磷酸化位点。首先，磷酸肽图揭示了假定的磷酸化位点数量，并给出了磷酸化特征。通过比较同一受体在不同组织中表达的磷酸化特征，我们揭示了受体磷酸化的多样性。
Edman降解可以在磷酸肽图谱的热点上进行，在那里收集降解的每个循环，干燥并斑点到滤纸上，并暴露在磷酸成象仪中，以显示该氨基酸是否被磷酸化。
这样就可以确定肽的哪个位置被磷酸化了。PAA分析揭示了该位点是否在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸上磷酸化。将这些数据与预测的蛋白水解消化产物相结合，就有可能确定哪些残留物被磷酸化了。
