首篇FFPE空间转录组文章小读:

文献名称: Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer. Immunity. 2022

背景介绍

    癌症TLS中免疫浸润的组成也称为三级淋巴器官或异位淋巴结构，是出生后在非淋巴组织中出现的免疫细胞的有组织聚集体。TLSs在生理条件下不存在，但在慢性炎症环境中形成。

TLS 结构

    利用多重荧光免疫组化技术（mIHC）评估肿瘤免疫微环境和TLS的成熟度。研究者认为，成熟的TLS（mTLS）由B细胞和CD23+ 滤泡树突状细胞（DCs）组成，与一个较小的CD4+和CD8+混合T细胞区相连。

免疫组化技术在组织中染色TLS结构

    三级淋巴结构又叫免疫相关淋巴组织，包括粘膜相关淋巴组织、皮肤相关淋巴组织等，主要包括B细胞、滤泡树突状细胞、T细胞、成纤维网状细胞、基质细胞、树突细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和内皮细胞。滤泡状树突细胞通常位于B细胞中心，表达各类受体，促进抗原递呈至B细胞，并驱动B细胞表达高活性的抗体。

TLS 形成 

    TLS存在于长期炎症部位的附近，这样的炎症引发原因可以是免疫疾病、传染病、器官移植、肿瘤、炎症性疾病等。在肿瘤中，TLS通常在肿瘤浸润部位产生。

    在TLS形成的过程中，首先是慢性炎症部位附近的基质细胞或者淋巴细胞分泌趋化因子CXCL13或者IL-7，招募淋巴组织诱导因子至炎性部位；淋巴组织诱导因子表达LTα1β2，结合到位于基质细胞的LTβR受体上，促进基质细胞分泌VEGFC (vascular endothelial growth factor C)，介导HEV (high endothelial venule) 形成。

TLS 结构优势

    为什么在慢性炎症条件下在感染或癌症部位创建淋巴生态位可能是有利的：

TLS 结构优势

（1）速度：T和B细胞池的局部启动可能导致更快的免疫反应，因为它规避了DC和淋巴细胞进出SLO的运输。

（2）效率：局部淋巴生态位的产生可能会增加疾病相关抗原和稀有匹配淋巴细胞之间相遇的可能性，从而可能能够诱导更强烈或更广泛的免疫反应。

（3）控制：拥有与发炎组织部位直接接触的淋巴生态位可能会提供额外的机会来引导免疫反应。

（4）存活：在一些TLS中存在大量功能失调的PD-1 high CD8+ T细胞，这是一种与优先肿瘤反应有关的表型，在该模型中，TLS不仅对诱导很重要，而且对维持免疫反应也很重要。

    TLS相关成纤维细胞和其他细胞亚群分泌的存活因子支持TLS中的淋巴细胞稳态，可能有助于肿瘤反应性T细胞在肿瘤部位的长期持续存在。

研究过程

    利用空间转录组, 免疫组学, Bulk BCR测序 等技术, 解读肾细胞癌组织中TLS结构与患者生存率的关系, 揭示TLS中B细胞的克隆类型, 推测并验证浆细胞随成纤维细胞转移至病灶区域, 呈现抗体与巨噬细胞共同完成癌细胞的消杀过程; 最终定义成熟的TLS结构与意义;

空间TME揭示TLS+相关区域富含B细胞

空间TME揭示TLS+相关区域富含B细胞

1. 使用冷冻（n = 12）和 FFPE 切片（n = 12）对 24 个 ccRCC 原发性肿瘤进行空间转录组学。在对切片进行 H&E 染色后，经验丰富的病理学家 (VV) 对每个肿瘤的整体组织以及 TLS 的存在和定位进行了注释。A: TLS+ 冷冻切片肿瘤、B: TLS+ FFPE 肿瘤、C: TLS- 冷冻切片肿瘤。

2. TLS+ 肿瘤中，B 细胞谱系（包含识别从幼稚细胞到 PC 的所有成熟步骤的基因）和 T 细胞（识别不同的 T 细胞群）基因特征优先在位于TLS 区域中表达 。这些肿瘤表现出 CD8 T 细胞特征的低表达，在 TLS 区域略有富集（p = 0.017）。TLS 中的单核细胞谱系特征略高（分别为 p = 0.00081 和 p = 0.035），而 NK 细胞更广泛地分布在整个肿瘤切片中。内皮细胞和中性粒细胞均匀分布，在 TLS 内得分较低），而在 TLS 区域发现成纤维细胞特征的高表达。

3. TLS 与 B 谱系、T 细胞和成纤维细胞特征的表达有关。

4. Ca9是ccRCC肿瘤细胞的标志物；

TLS 内外差异基因差异分析锁定差异: 免疫球蛋白+B细胞

TLS 内外差异基因差异分析

1. 三重免疫荧光（IF） 标记 (CD20/CD3/PD-1) 确认 H&E 定义的 TLS 位置；

2. 9/10 的 TLS+ 肿瘤中 AUC 范围为 0.75 至 0.93 ；1/10样本的 AUC 为 0.62 且 TLS 印记特征表达较弱(该肿瘤缺乏 TLS 成熟度标志物，例如 CD23 和 BCL6，以及外周淋巴结寻址素阳性 (PNAd+) 高内皮小静脉 (HEV));

3.  TLS imprint 标志物: 对TLS内部区域和外部区域进行了差异基因表达分析（logFC>1, p.adjust <0.05，不同样本存在overlap)，获得 TLS imprint 的标志物: 12 个免疫球蛋白基因、5 个 B 细胞标志物， 2 个 T 细胞标志物、2 个成纤维细胞标志物、2 个补体蛋白编码基因，以及 CD52、APOE、PTLP、PTGDS、PIM2 和 DERL3 基因。

Ig 和 B 细胞相关基因在 TLS 区域显著富集促使研究关注 B 细胞

Ig 和 B 细胞相关基因在 TLS 区域显著富集促使研究关注 B 细胞

1. 精确定位与 TLS 相关的转录不同的 B 细胞亚型: 通过 RCTD 对单细胞分析中定义的 B 细胞亚群进行空间映射；

2. PC （浆细胞）相关基因 MZB1 （浆母细胞特征基因）的表达在 TLS 中高，而在冷冻切片肿瘤区域中总体低。

3. 由于浆母细胞不仅限于 TLS 区域，在 TLS 外发现 MZB1 的高表达: MZB1 的 PC 可能不仅存在于 TLS 中，而且存在于肿瘤区域；

4. 由于 PC 的主要功能是产生抗体，分析了免疫球蛋白基因的空间表达：IGHM 几乎只在 TLS 区域表达，增强了 TLS 内非转换 B 细胞的存在； IGHG1、IGHA1 和 pan Ig（IGKC 和 JCHAIN 的几何平均值）基因在 TLS 区域以及远端区域高度表达。 IGHG1 和 IGHA1 的分散表达表明同种型转换的 PC 已在 TLS 中形成并在远处迁移。

5. 成纤维细胞标记 COL1A1 的高表达;

6. CXCL12 （趋化因子, 与位于骨髓、淋巴结和慢性炎症组织中的 PC 迁移和滞留有关）的表达与 MZB1 的表达共定位。

空间 BCR 识别原位超突变和克隆选择

空间 BCR 识别原位超突变和克隆选择

A. TLS区域也发现了数量最多的独特轻链克隆型;

B. TLS区域VL基因突变少于或等于中位数; 与TLS相距较远的肿瘤区域大多高突变;

C.  TLS区域和肿瘤区域VL突变计数统计;

D. 统计47例ccRCC样本轻链和重链突变计数; TLS高, 体细胞突变(VL,VH)水平显著较高;

体细胞超突变是否伴随着克隆型选择?

E. TLS高->总克隆型数目多+超过100倍的克隆型计数比例较高;

BCR克隆类型与空间分布

BCR 进化树与空间分布

F. CDR3 序列构建进化树:

点的大小表示每个克隆型的计数数量，点的颜色表示克隆型所在的不同空间点的数量;

√ found in both spatial and bulk analyses from the same tumor;

G. 同一家族的克隆型聚集在TLS附近聚集; 在远离TLS区域稀疏分布;

浆细胞从TLS沿成纤维细胞轨道传播

浆细胞从TLS沿成纤维细胞轨道传播

备注: CD20: B淋巴细胞抗原; CD3: T细胞的共同的表面标志; MUM1: 表达于正常的浆细胞、晚期B细胞和活化的T细胞;    IgG/IgA: 血浆B细胞产生和释放的一种抗体;COL1: 成纤维细胞标记;    CXCL12: 与位于骨髓、淋巴结髓索和慢性炎症组织中的 PC(plasma cell) 生态位中的 PC 迁移和滞留有关;

    为了分析肿瘤内PCs和成纤维细胞的位置以及CXCL12的原位表达，使用多重IF标记FFPE肿瘤切片，利用多发性骨髓瘤癌基因（MUM1）作为PCs和成纤维细胞COL1（Col1a）的特异性标记。

    通过连续玻片上的显色CD3/CD20标记，在TLS区域内检测到双阳性MUM1+IgG+PC和少量MUM1+IgA+PC(4A);

    COL1+/CXCL12+成纤维细胞与MUM1+ PC并列(B);

    COL1+/CXCL12+成纤维细胞与MUM1+ PC并列(C);

    PC沿着纤维母细胞轨道排列，嵌入COL1+CXCL12+成纤维细胞的密集网络中;

PC与COL1+成纤维细胞轨迹图

PC与COL1+成纤维细胞空间位置

1. 绝大多数PC与成纤维细胞非常接近，两种肿瘤的平均距离分别为17.5和19 mm，图G和K显示了距离分布;

2. 44个肿瘤样本的平均距离为25.7 mm;

3. Ig和成纤维细胞转录物的共同表达，以及成纤维细胞转录物和CXCL12的共同表达（图2E）;验证了PCs在TLS内以及沿空间转录组学确定的成纤维网状细胞（FRC）轨迹的位置。引人注目的是，在被MUM1+IgG+成纤维细胞轨道包围的肿瘤巢中检测到与肿瘤细胞结合的IgG（图4F和4J）。

产生Ig的PC与结合到凋亡肿瘤细胞上的IgG抗体与机体对免疫治疗的反应相关

产生Ig的PC与结合到凋亡肿瘤细胞上的IgG抗体与机体对免疫治疗的反应相关

备注: CD20: B淋巴细胞抗原; CD3: T细胞的共同的表面标志; MUM1: 表达于正常的浆细胞、晚期B细胞和活化的T细胞;    IgG/IgA: 血浆B细胞产生和释放的一种抗体;    CD23是人类B淋巴细胞表面的一种分化抗原; PNAd: 抗体;  Bcl-6是一种编码原癌基因蛋白，具有诱导细胞凋亡功能。Bcl-6主要表达在正常生发中心B细胞以及相关淋巴瘤中;

B：成熟TLS的特征是含有GC B细胞区，B细胞区被T细胞区包围，其中存在CD4+ PD1+ T细胞、CD4+ PD1+ CXCR5+ Tfh细胞和CXCL13+ 细胞;

C: GC区的特征是在外围检测到CD23+滤泡树突状细胞（FDC）、BCL6+CD20+B细胞和PNAd+ HEV网络;

D: TLS的存在与MUM1+ IgG+细胞密度和MUM1+IgA细胞密度之间存在显著相关性;

E: 含有CD23+ FDC网络的TLS、BCL6+细胞和PNAd+ HEV与MUM1+ IgG+ PC和MUM1+ IgA+ PC密度之间存在很强的相关性;

成熟TLS的特征

成熟TLS发挥功能研究与癌症治疗效果说明

A. CAIX 是一种跨膜蛋白，在发育中的侵袭性肿瘤组织中过度表达，负责调节细胞内外的pH平衡; 黄色虚线方框和箭头表示双阳性细胞。

B.  根据TLS状态，IgG+（左）和IgA+（右）肿瘤细胞的百分比（n=103）。

C. 根据MUM1+IgG+PC的密度，IgG+肿瘤细胞的百分比（n=103）。

D. 根据MUM1+IgA+PC的密度，IgA+肿瘤细胞的百分比（n=103）。

E. caspase-3（绿色）染色显示肿瘤细胞发生凋亡。

G. CD68+巨噬细胞与IgG+裂解的caspase-3+肿瘤细胞的共定位。

凋亡细胞数量多且IgG染色肿瘤细胞百分比高的肿瘤更容易被CD68+巨噬细胞浸润;

与低IgG肿瘤细胞患者相比，高IgG肿瘤细胞患者的PFS要长得多;

内容概述

TLS 结构, 传播, 抗肿瘤过程 示意图

    针对ccRCC原发性肿瘤，作者做了12个冷冻切片空间转录组和12个FFPE切片空间转录组并结合BCR分析、多色免疫荧光等分析，发现肿瘤中的三级淋巴结构产生成熟B细胞，浆细胞扩散到肿瘤基部中，产生抗体与肿瘤细胞结合并引发其凋亡。

    B细胞在TLS中富集。BCR分析显示TLS中的克隆多样性、选择、扩展，以及远处存在完全成熟的克隆型。

    在TLS+肿瘤中，产生IgG和IgA的PC沿着成纤维细胞的轨迹播散到肿瘤区域。

    TLS+样本具有高丰度IgG的PC和凋亡的恶性肿瘤细胞，提示具有抗肿瘤效应物活性。

    在接受免疫检查点抑制剂治疗的RCC患者中，治疗反应和无进展生存率与IgG染色的肿瘤细胞相关。

    结论: 肿瘤内TLS维持B细胞成熟和抗体产生，这与免疫治疗反应相关，可能通过直接抗肿瘤作用实现。

参考文献: 

Maxime Meylan, Florent Petitprez, et al. Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer. Immunity. 

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