2021.10.13-10.21 MIXCR学习笔记

2021-10-21 本文已影响0人千容安

>>准备工作

安装

下载mixcr
命令行输入：java -jar D:\mixcr-3.0.13\mixcr.jar align input.fastq.gz output.vdjca
切换工作路劲：cd C:\mixcr-3.0.13
输入：java -jar mixcr.jar

>>背景知识

典型的MiXCR工作流程主要由三个部分构成：

align：将测序结果比对到T细胞或B细胞受体的V、D、J、C基因参考序列上
assemble：利用前一步骤获得的比对结果拼接clonotypes（为了提取特定的基因区域信息，比如CDR3）
export：输出比对结果（exportAlignments模块）或者clones信息（exportClones模块），生成可读文件

MiXCR的assemble模块有几种不同的拼接方法可以选择：

assembleContigs：拼接完整的TCR或者IG受体clonotype序列
对于RNA-Seq or non-targeted DNA data, 工作流程可能包括以下两部分：
- assemblePartial：将有重叠区域的序列片段拼接成相对较长的包含CDR3区域的contigs
- extend: 估算测序和比对质量较好但长度较短的TCR比对序列的germline序列

为了简化输入命令，MiXCR提供了analyze命令模块，打包了整个分析流程
MiXCR支持一下若干种数据类型：fasta，fastq，fastq.gz，paired-end fastq和fastq.gz。作为每一步骤的输出结果，MiXCR生成包含各种信息的二进制压缩文件（比对生成alignments，拼接生成clones）。利用exportAlignments和exportClones命令模块，每一个二进制文件都可以转化成tab分割的可读文本文件。
analyze模式，可以一站式完成(align、assemblePartial、extend、assemble、assembleContigs、export) 这些分析
使用的数据来源：

第一次输入：有错误
java -jar ./mixcr.jar analyze amplicon --species hs --starting-material dna --5-end v-primers --3-end j-primers --adapters adapters-present --receptor-type IGH A1_1.clean.fq A1_2.clean.fq analysis

不关命令行，ctrl+c即可停止正在进行的命令
hs改为mmu，是小鼠的数据，IGH改成TCR，老师没有做过BCR的数据
改成输入：
java -jar ./mixcr.jar analyze amplicon --species mmu --starting-material dna --5-end v-primers --3-end j-primers --adapters adapters-present --receptor-type TCR A1_1.clean.fq A1_2.clean.fq analysis
得到文件如下：

其中TRA如下：
analysis.clonotypes.TRA
用了老师给的十几个数据的前两个样品，这个文件将V、D、J基因数据都囊括。
目标是得到老师要求的table，模板之一如下：
TRA.V
是将所有样品中TRA.V的基因都整合。
老师说进一步用vdjtools的Convert过滤数据
由帮助信息可知，convert在util里面，在官网上找到命令行
用法、帮助信息
option为加-S MiXcr，表示输入数据为mixcr结果
命令：java -jar ./vdjtools-1.2.1.jar Convert -S MiXcr analysis.clonotypes.TRA.txt output_prefix
得到结果如下：
output_prefix.analysis.clonotypes.TRA
对table的一些解读：

这部分，标记的应该是CDR3片段上面，VDJ基因的分界点

freq就是频数。毕竟T细胞需要大量克隆，才能应对特定的病变细胞。count就是TCR重复的数目。这个数目以核酸序列为准来计算的。

若最后4列是-1，则它们就不必考虑，这里的-1，表示没有有效数据，当作NA处理