单细胞转录组数据分析||Garnett细胞类型注释工具

Garnett是一个从单细胞表达数据中实现自动细胞类型分类的软件包。Garnett的工作方式是获取单细胞数据和细胞类型定义(marker)文件，并训练一个基于回归的分类器。一旦被训练成一个针对某一组织/样本类型的一个分类器，它就可以应用于从相似组织中对未来的数据集进行分类。除了描述训练和分类功能，这个网站的另一个目标是成为一个存储以前训练出来的分类器仓库。

安装Garnett

R> 3.5
依赖Monocle（3），注意：Garnett 不再支持monocle2官网这样写真的很困惑，因为后面的例子很多还是基于monocle2的。

# First install Bioconductor and Monocle
if (!requireNamespace("BiocManager"))
    install.packages("BiocManager")

BiocManager::install()
BiocManager::install(c("monocle"))

# Next install a few more dependencies
BiocManager::install(c('DelayedArray', 'DelayedMatrixStats', 'org.Hs.eg.db', 'org.Mm.eg.db'))

install.packages("devtools")
devtools::install_github("cole-trapnell-lab/garnett")

library(garnett)

Garnett工作流有两个主要部分，每个部分的详细描述如下:

• Train/obtain the classifier: 要么下载现有的分类器，要么训练自己的分类器。为了训练，Garnett解析一个标记文件，选择一组训练细胞，然后训练一个多项分类器来区分细胞类型。

• Classify cells: 接下来，Garnett将分类器应用于一组细胞，以生成cell类型。Garnett还可以选择将分类扩展到类似的细胞，以生成一组独立的分群扩展类型。

使用预先训练的分类器

我们已经为各种生物和组织生成了一系列预先训练的分类器。如果您的数据类型存在一个预先训练好的分类器，我们建议您尝试一下。可用的分类器列表可以在这里找到。我们希望在生成新的分类器时不断地更新和添加它们。我们也接受由其他人产生的分类器-请提交你所做的任何分类器并帮助建立社区!关于如何提交分类器的详细信息可以在这里找到。

目前已有的分类器模型：

Classifier	Marker file	Species	Tissue	Contributer	Training data source	Publication
hsLung	hsLung_markers.txt	Human	Lung	Hannah Pliner	Lambrechts et. al.	Pliner et. al.
hsPBMC	hsPBMC_markers.txt	Human	PBMC	Hannah Pliner	10x Genomics	Pliner et. al.
mmLung	mmLung_markers.txt	Mouse	Lung	Hannah Pliner	Han et. al.	Pliner et. al.
ceWhole	ceWhole_markers.txt	C. elegans	Whole	Hannah Pliner	Cao et. al.	Pliner et. al.
mmBrain	mmBrain_markers.txt	Mouse	Brain and spinal cord	Hannah Pliner	Zeisel et. al.	Pliner et. al.

根据你的组织类型下载一个吧。

使用一个预先训练好的分类器，首先下载分类器，然后将它加载到你的R会话使用:

classifier <- readRDS("path/to/classifier.RDS")

因为Garnett 建立在 Monocle
上，所以Garnett 的数据保存在CellDataSet (CDS)类的对象中。这个类派生自Bioconductor ExpressionSet类，它为那些分析过生物微阵列实验的人提供了一个常见的接口。Monocle提供了关于如何生成输入cds的详细文档here。

例如，Garnett包含一个来自PBMC 10x V1表达式数据的小数据集.

# load in the data
# NOTE: the 'system.file' file name is only necessary to read in
# included package data
#
mat <- Matrix::readMM(system.file("extdata", "exprs_sparse.mtx", package = "garnett"))
fdata <- read.table(system.file("extdata", "fdata.txt", package = "garnett"))
pdata <- read.table(system.file("extdata", "pdata.txt", package = "garnett"),
                    sep="\t")
row.names(mat) <- row.names(fdata)
colnames(mat) <- row.names(pdata)

# create a new CDS object
#pd <- new("AnnotatedDataFrame", data = pdata)
#fd <- new("AnnotatedDataFrame", data = fdata)
pbmc_cds <- new_cell_data_set(as(as.matrix(mat), 'sparseMatrix'),
                              cell_metadata = pdata,
                              gene_metadata = fdata)

# generate size factors for normalization later
#pbmc_cds <- estimateSizeFactors(pbmc_cds)#

有了分类器之后，就可以使用classify_cells函数对细胞进行分类了!关键的点是:

• cds : 是包含您的基因表达数据的CDS对象(见上面)。
• classifier:这就是您在上面获得的garnett_classifier
• db: db : 是用于转换基因id的生物导体注释db类包的必要参数。例如，对于人类使用org.Hs.eg.db。在Bioconductor网站上可以找到相关的包装。使用library(db)加载您选择的db。如果您的物种没有带注释的db类包，请参见这里。
• cluster_extend:这告诉Garnett是否创建第二组任务，将分类扩展到相同群中的细胞。您可以在名为“garnett_cluster”的列的pData表中提供分群的id，也可以让Garnett分群并填充。

警告:如果不提供“garnett_cluster”列，并将一个非常大的数据集的cluster_extend设置为TRUE，则此函数的运行速度将大大降低。为了方便起见，Garnett将它计算的集群保存为“garnett_cluster”，因此如果再次运行该函数，速度会更快。

• cds_gene_id_type 这个告诉garnett你的cd对象中基因id的格式。它应该是列(db)中的一个值。默认是“ENSEMBL”。

classify_cells函数在pData表中返回一个(如果cluster_extend = TRUE，则返回两个)包含Garnett分类的新列的输入CDS对象。

pbmc_classifier<-hsPBMC
library(org.Hs.eg.db)
pbmc_cds <- classify_cells(pbmc_cds, pbmc_classifier,
                           db = org.Hs.eg.db,
                           cluster_extend = TRUE,
                           cds_gene_id_type = "SYMBOL")


head(pData(pbmc_cds))

DataFrame with 6 rows and 7 columns
                           tsne_1           tsne_2
                        <numeric>        <numeric>
AAGCACTGCACACA-1  3.8403149909359 12.0841914129204
GGCTCACTGGTCTA-1 9.97096226657347 3.50539308651821
AGCACTGATATCTC-1 3.45952940410281 4.93527280576176
ACACGTGATATTCC-1 1.74394947394641 7.78267061846286
ATATGCCTCTGCAA-1 5.78344829514223 8.55889827553495
TGACGAACCTATTC-1 10.7928530485958 10.5852739146963
                       Size_Factor   FACS_type garnett_cluster
                         <numeric> <character>       <logical>
AAGCACTGCACACA-1 0.559181445161514     B cells              NA
GGCTCACTGGTCTA-1 0.515934033527584     B cells              NA
AGCACTGATATCTC-1 0.698028398302026     B cells              NA
ACACGTGATATTCC-1 0.815631008885519     B cells              NA
ATATGCCTCTGCAA-1  1.11532798424345     B cells              NA
TGACGAACCTATTC-1 0.649469901028841     B cells              NA
                   cell_type cluster_ext_type
                 <character>      <character>
AAGCACTGCACACA-1     B cells          B cells
GGCTCACTGGTCTA-1     B cells          B cells
AGCACTGATATCTC-1     B cells          B cells
ACACGTGATATTCC-1     B cells          B cells
ATATGCCTCTGCAA-1     B cells          B cells
TGACGAACCTATTC-1     Unknown          Unknown

table(pData(pbmc_cds)$cell_type)
 B cells           CD34+     CD4 T cells     CD8 T cells 
            321               1              89              52 
Dendritic cells         T cells         Unknown 
             12             160             165 

table(pData(pbmc_cds)$cluster_ext_type)

        B cells     CD4 T cells Dendritic cells         T cells 
            373             200               3             200 
        Unknown 
             24 

qplot(tsne_1, tsne_2, color = cell_type, data = as.data.frame(pData(pbmc_cds))) + theme_bw()

qplot(tsne_1, tsne_2, color = cluster_ext_type, data = as.data.frame(pData(pbmc_cds)))+ theme_bw()

上面的第一个图显示了Garnett的cell类型分配，第二个图显示了Garnett的集群扩展类型分配。您可以看到，T细胞子集(CD4和CD8)在这些集群中并没有很好地分离，因此在计算集群扩展类型时，Garnett将层次结构退回到更可靠的“T细胞”分配。
因为这个示例数据来自FACS排序的细胞样本，所以我们可以将Garnett的分配与“真正的”细胞类型进行比较。

Troubleshooting

Common marker file errors

这里，我们提供了一些常见的标记文件错误和Garnett分类的潜在结果的例子。对于所有面板，分类器在10x PBMC version 2 (V2)数据上进行训练，然后使用分类器对上面所示的10x PBMC version 1 (V1)数据进行分类。第一个面板由基于facs的10x单元类型分配着色。其余的面板由Garnett集群无关的细胞类型分配着色。

• A cell type is missing from the marker file。在PBMC标记文件中，不包括T细胞定义(面板2)。在原稿中讨论的例外情况是，缺失的细胞类型(即表达NK标记FCGR3A的NKT细胞)中存在描述现有细胞类型的特征。

• A cell type is defined but includes no good specific markers. 在PBMC标记文件中，只使用CD4而不是CD3来定义T细胞(面板3)。在这种情况下，我们发现Garnett只标记了T细胞的一个子集，而未标记其余细胞。

• A gene that is not specific and widely expressed is used to define a cell type. 如果我们将MALAT1 (PBMC数据集中表达最多的转录本)添加到T细胞定义(面板4)中，在这种情况下，我们会发现每个细胞类型最终都在真细胞类型和T细胞之间混合分配。在另一种情况下，包含一个广泛表达的非特异性基因可能会导致Garnett根本找不到足够的训练样本，因为它会认为所有细胞都是模糊的(即它们会表达其他标记加上非特异性的)。

• A cell type definition includes genes that are specific to another cell type. 是这样一个定义在哪里真正的“错误”,即如果B细胞(CD79A)是最好的标记添加到T细胞的定义(面板5)。我们发现B细胞集群混合细胞类型任务的B细胞和T细胞,但是剩下的细胞类型的标签主要不变。

My species doesn't have an AnnotationDbi-class database
If your species doesn't have an available AnnotationDbi-class database, then Garnett won't be able to convert among gene ID types. However, you can still use Garnett for classification. Set db = 'none' and then be sure that you use the same gene ID type in your marker file as your CDS object. When db = 'none' Garnett ignores the arguments for gene ID type.

citation("garnett")

# Hannah A. Pliner, Jay Shendure & Cole Trapnell (2019). Supervised classification enables rapid annotation of cell atlases. Nature Methods
#
# A BibTeX entry for LaTeX users is
#
#   @Article{,
#     title = {Supervised classification enables rapid annotation of cell atlases},
#     journal = {Nature Methods},
#     year = {2019},
#     author = {Hannah A. Pliner and Jay Shendure and Cole Trapnell},
#   }
#

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1b-train-your-own-classifier