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简介

这是一篇发表于《Nature Reviews Gentics》上的一篇综述，名称为《实验重复在减少NGS测序错误中的作用》。虽然NGS测序技术的进步使得测序的保真性提高，测序错误率下降。但是考虑到人基因组数以十亿的碱基，极低的错误率仍然会在变异检测过程中产生许多的错误。一些错误变异和真实的somatic突变、稀有突变十分类似，下游实验验证这些假阳性变异会花费巨大。这篇文章主要描述了高通量实验中的错误来源，以及怎么利用重复来减少这些错误。

1 NGS中的错误来源

NGS错误可以来源于实验流程的各个步骤：样本处理、文库制备、测序及成像或拍照步骤。

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1.1 样品制备

1. 实验人员失误；例如，贴错标签。
2. DNA或RNA的降解；例如，组织自溶，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织制备过程中的核酸降解和交联。
3. 异源序列的污染；例如，支原体和异种移植的宿主污染。
4. DNA起始量低。初始基因组产物数量不足、质量较低会导致扩增错误增多、并降低测序深度

1.2 文库制备

1. 实验人员失误；例如，一个样品的DNA残留到下一个，之前反应的污染。
2. PCR扩增错误。
3. 引物偏倚；例如，结合偏倚，甲基化偏倚，错配偏倚，非特异性结合、引物二聚体、发夹结构的形成，熔解温度太高或太低引入的偏倚。
4. 3’端捕获偏倚，在RNA测序的poly(A)富集过程中引入。
5. 独有突变；例如，由重复区域或独有变异的错配而引入的突变。
6. 机器故障；例如，PCR循环温度不正确。
7. 嵌合体reads的形成。会引起双端reads文库较长的插入、错误突变、组装错误。
8. barcode和/或接头错误；例如，接头污染，barcode多样性不足和barcode不兼容。会造成序列的污染、序列数量的损失、质量的下降。

1.3 测序和成像

1. 实验人员失误；例如，流动槽过载引起的各簇之间的交叉污染。
2. 移相；例如，延伸不完整以及多个核苷酸而不是单个核苷酸的加入。
3. “Dead”荧光基团；例如，核苷酸损坏以及信号重叠。
4. 序列区域；例如，富含GC，同源和低复杂度的区域，及均聚物。
5. 机器故障；例如，激光、硬盘、软件和流体系统出故障。
6. 链的偏倚。

2 利用实验重复减少NGS错误

2.1重复类型

重复类型包括，测序reads覆盖深度、技术重复（分析相同的样本，经历相同的处理步骤）、生物学重复（分析来自同一宿主的不同生物样本，经历相同的处理步骤）和跨平台重复。
目前减少测序错误的方法主要集中在后处理过滤策略上，包括过滤测序reads深度、碱基质量值、比对质量值、变异质量值、已知变异位点、链偏好性、等位基因不平衡性、序列上下文。这些后处理步骤综合考虑，可以提高最终变异检测的精度（FIG 1.b）

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2.2利用重复优化过滤阈值

生信过滤参数可以通过技术重复、生物学重复和跨平台重复优化，提高流程的灵敏度和特异性。例如，每个人约有300万个变异位点，但是由于短序列的比对错误、嵌合体影响以及测序错误，变异软件可以检测出多达2000万个不同变异质量的变异。我们就可以利用重复的基因组序列进行测序，对变异阈值或者其他参数进行筛选，过滤假阳性变异。
如图2所示，类似于ROC曲线，可以根据重复实验选择出一致检出的突变位点（备选的真阳位点）和不一致检出的位点（备选的假阳位点），并按照优化参数（变异质量值，比对质量值）值进行排序，随着优化参数值的降低（降低筛选的严格程度），如果真阳变异和假阳变异在某一参数数值达到比较好的分离，就可以确定阈值。
图2中，X轴 "Fraction of discordant SNVs" 表示在特定阈值或以下的假阳性(不一致)变异数量占所有质量分数检测的假阳性(不一致)变异数量的比例。Y轴 "Fraction of concordant SNVs" 表示在特定阈值或以上的真阳性(一致)变异数量占所有质量分数检测的真阳性(一致)变异数量的比例。

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参考文献：

[1] Robasky K , Lewis N E , Church G M . The role of replicates for error mitigation in next-generation sequencing[J]. Nature Reviews Genetics, 2014, 15(1):56-62.