m6A RNA Methylation Is Regulated by MicroRNAsandPromotes Reprogramming to Pluripotency

摘要：m6A目前已经被确认为真核生物mRNA保守性的表观修饰，但是其在细胞“重新编程”过程中的特点、调控机制和功能还了解的很少。本文通过比较分析基因和细胞特异性的mRNAm6A甲基化的几个特点，揭示了4种不同分化程度的多功能细胞mRNA的m6A修饰。

另外，本文还展示了microRNA通过碱基互补调控RNA的m6A修饰，miRNA的表达或序列通过METTL3结合到mRNA的miRNA结合位点上改变mRNA的甲基化水平。m6A水平的增加促进小鼠纤维母细胞向多功能干细胞分化，而m6A水平的降低则阻碍分化。这些结果揭示了microRNA在Mrna甲基化上的一种功能，为未来研究m6A在细胞“重新编程”过程中的功能提供新的依据。

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1、meRIP-sep分析：m6A在mRNA的microRNA结合位点上富集

为了探究m6A的序列特点，作者通过meRIP-seq的方法对所有细胞类型进行了m6A位点的分析，发现所有类型细胞有87%的M6A峰值位于GGACU上；在包含m6A的序列中有67%–89%与miRNA序列的5’端能进行反向互补，说明这些位点可能是microRNA的结合靶标位点。如下图：

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图注：A是各种类型细胞中m6A峰值富集的共同motif序列；B是共同的m6A motif与相应microRNA的互补配对情况；C是另外两种m6A富集的Motif与相应microRNA互补配对的情况；D是microRNA靶标的m6A富集的motif的百分比。

2、microRNA通过影响METTL3与mRNA的结合，影响M6A水平。

（1）Dicer敲低使m6A水平下降，dicer过表达使m6A水平上升。

为了探究microRNA对m6A修饰是否产生影响，作者分别对小鼠NSC和人Hela细胞的dicer酶（对ciroRNA前体加工使其形成成熟miroRNA的限制性内切酶）进行过表达和敲低处理后，对细胞总RNA进行m6A dot blot检测m6A的相对含量，同时WB检测甲基化酶METT3和去甲基化酶FTO的表达，表明dicer酶过表达后RNA的m6A含量升高dicer酶敲低后RNA的m6A含量降低，而与甲基化相关的修饰没表达并不受影响，说明RNA的m6A修饰受dicer酶表达水平的影响。如下图：

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图注：A和B是dicer酶过表达后的m6A dotblot检测RNA的m6A含量和WB检测甲基化相关的修饰酶；C和D是dicer酶敲低后的m6A dot blot检测RNA的m6A含量和WB检测甲基化相关的修饰酶。

（2）microRNA促进mRNA的甲基化

为了探究microRNA是否调控m6A的形成，作者从与m6A富集的mitif配对的MicroRNA中随机选择几种MicroRNA在小鼠NSC细胞中进行过表达和敲低后Q-PCR检测m6A的含量，表明microRNA过表达使m6A升高，microRNA敲低后m6A含量降低。说明microRNA对m6A的形成具有促进作用。如下图：

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图注：A为随机选择的几种microRNA在小鼠NSC细胞中过表达后Q-PCR检测相应mRNA的m6A形成情况；B为microRNA在小鼠NSC细胞中敲低后Q-PCR检测相应mRNA的m6A形成情况。说明microRNA促进其靶标mRNA的m6A修饰。

（3）microRNA通过介导METTL3与mRNA结合促进RNA的m6A修饰

上面的研究表明microRNA促进mRNA的甲基化修饰，于是作者推测microRNA通过介导RNA甲基化修饰酶METTL3结合到mRNA上进行m6A修饰。为了验证这个猜想，作者首先检测dicer的表达是否会影响METTL3的细胞定位和功能，通过核质分离实验检测表明dicer的表达不会影响METTL3的细胞分布；随后作者通过CLIP验证microRNA对mRNA与METTL3结合的影响，dicer酶敲低使得METTL3与mRNA的结合降低。如下图：

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图注：A是核质分离实验检测METTL3的细胞定位和分布；B和C是dicer酶敲低后用带Myc标签抗体进行的CLIP实验，表明dicer敲低后METTL3与RNA结合降低。

接着为了更直接的说明microRNA对METTL3和mRNA结合的影响，作者通过METTL3的RIP-QPCR检测microRNA过表达后mRNA与METTL3的结合，说明microRNA对METTL3与mRNA的结合具有促进作用。如下图：

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图注：对几种microRNA进行过表达后，用METT3抗体进行RIP获取与METTL3结合的RNA,然后q-pcr检测相应结合的mRNA，表明microRNA对METTL3与mRNA结合有影响。

3、m6A的活跃促进细胞的“重新编程”功能

为了研究m6A对细胞功能的影响，作者分别对METTL3进行过表达和敲低使m6A修饰增加和降低后检测细胞的干性分化情况：检测干性相关基因表达。表明m6A修饰与细胞干性正相关。

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图注：分别对METTL3进行过表达和敲低后检测干性相关基因的表达情况。

文献原文：TongChen,Ya-Juan Hao,YingZhang,et al.m6A RNA Methylation Is Regulated by MicroRNAsandPromotes Reprogramming to Pluripotency[J].Cell Stem Cell,2015,16,289–301