宏基因组怎么分析？
文章分析思路：整体概述——物种组成——功能组成——关联/因果
文章主要结果描述：
1. 样本、物种、功能整体内容描述
2. 物种组成整体差异和分组具体差异
3. 功能组成整体差异和分组具体差异
4. 环境因子/相关研究与微生物组的关系——关联；无菌体系验证差异物种——因果；
文献实例1：人肠道微生物的肠型（宏基因组）
Ref：Arumugam, M., Raes, J., Pelletier, E., Le Paslier, D., Yamada, T., Mende, D. R., … & Bertalan, M. (2011). Enterotypes of the human gut microbiome. nature, 473(7346), 174.
图1. 人类肠道微生物组的物种和功能组成
a. 模拟随着样品数量增加，非冗余直系同源基因分组数量增长变化趋势。完整的细菌基因组按生活环境分为已知肠道相关(红色)、非肠道相关(蓝色)物种两类。前者在35个样品时接近饱和，而非肠道物种(通常稀少和短暂的)并没有饱和。
b. 箱线图展示最高丰度的30个属。按门着色。同时角上有门水平箱线图。属和门水平丰度计算采用有参比对，85%相似度，65%覆盖度的阈值。末分类的属显示更高水平标注了星号。
c. 箱线图展示最高丰度的30个直系同源基因分组(基于eggNOG)数据库，并按其功能分类着色。
图2. 肠型的物种组成不同
a. 基于33个宏基因组属组成的主成分分析和聚类。与1511个参考基因组比对，基于85%相似度阈值。
b. 85个发表丹麦人的Illumina宏基因组数据；
c. 152个16S扩增子测序。均显示出稳健的聚类结果——肠型。IBD，肠易激综合证和肥胖用三角和五角星标出，表现出也符合肠型规律，但与主体略有差异。采用R的ade4包绘制两个主成分，每个点填充的圆代表样品。每一个簇的重心标记为长方形，并添加67%的置信椭圆。
d. 三个代表菌属的相对丰度箱线图，三种肠型的典型菌为拟杆菌属、普氏菌属和瘤胃球菌属。
f. 每种肠型主要的贡献者的共丰度网络。
图3. 肠型间的功能差异
a. 采用COG数据进行PCA分析，仍然获得同样的三种肠型结果(空圈显示不同样品)。蓝色密度图代表COG相对丰度。
b. 在肠型1中4个生物素合成途径中富集(COG0132, COG0156,COG0161和COG0502)，
c. 在肠型2中富含的4个硫胺素生物合成途径 (COG0422, COG0351, COG0352和COG0611)
d. 在肠型3中血红素合成途径富集(COG0007, COG0276, COG407, COG0408, COG0716 and COG1648)
图4. 与宿主属性的相关
a. RNA聚类酶与年龄相关；
b. susD淀粉结合与BMI相关
c. 4个COG组合模型与年龄高度相关
d. 2个COG组合(ATP酶复合物与四氢嘧啶)模型与BMI高度相关
文献实例2：全球柑橘根系微生物结构和功能（16S+宏基因组）
Ref：The structure and function of the global citrus rhizosphere microbiome. Nature Communications ( IF 12.121 ) Pub Date : 2018-11-20 , DOI: 10.1038/s41467-018-07343-2
1. 柑橘根际微生物群落的特征
a. 从16S扩增子和宏基因组两方面展示了非根际土和根际土之间的物种分布。
b.不同区域的非根际土和根际土之间的Alpha多样性。
c. PCoA图。不同区域的非根际土和根际土之间的PCoA。
2.柑桔根际核心微生物的特征
a. 维恩图。描述核心微生物从非根际土壤到根际土壤的属富集情况。
b. 物种丰度热图。在根系土壤中富集的优势微生物（细菌）主要是变形菌、放线菌、酸杆菌和拟杆菌四大门；（真菌）子囊菌门。
3.柑桔根际微生物的功能
a. unigene集
b. KOs在KEGG第二层级的注释结果
c. 根际土的Enriched KOs（C图）根际土的与非根际土KOs的Venn图
d. 根际土的Depleted KOs与非根际土KOs的Venn图
e. KOs在KEGG第三层级的注释结果（*p值< 0.05;**p值< 0.01;***p值< 0.001）
4. 柑橘根际微生物的功能富集讨论
也没有太难对吧，快开始你的宏基因组构想吧！
加油，青椒们！
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