2018-11-18学习小组Day7笔记--测序相关知识（李夕）

基本名词

1. 测序平台：Hiseq2500,Hiseq X ten
2. Flowcell：流动池，用于吸附流动DNA片段的槽 道，包含8条泳道（lane）
3. Lane：泳道，可以使用Barcode在单Lane中检测多样本
4. Barcode：区分样本的标签，是一级序列
5. PE：pair-end，双向测序，双端测序，即一个片段，从正向和反向各读一次，2x150bp
6. SE：single-end，单向测序，单端测序，只读一次，1x150bp
7. Read：一个读长，又叫读段，是一段碱基序列，Reads是read的集合
8. 测序深度：测序得到的碱基总量(bp) 与基因组大小的比值，它是评价测序量的标志之一
9. 测序覆盖度：基因组被测序得到的碱基覆盖的比例
10. 数据量：所测到的碱基总数，1kb=1000bp
11. Fragment：一个DNA片段

学习内容

1. 区分一二三代测序
2. 二代测序大体流程
3. NGS组学分类

1. 测序原理
   主要为Sanger法（第一代DNA测序技术），即双脱氧核苷酸法。
   ddATP,ddTTP,ddGTP,ddCTP都是带有放射性同位素标记的双脱氧核苷酸，分别对应不同的碱基ATGC，由于其结构中比脱氧核苷酸多脱掉一个氧，即不含羟基，无法在DNA合成过程中形成磷酸二酯键，因此可中断DNA链的继续合成。

在测序过程中，将待测样品分为4份，每份改变一种脱氧核苷酸，如将dATP改为ddATP，这样一来，复制过程中将会在原来A的位置终止复制，复制结束后，第一份样品中素有片段皆是以ddATP为终端的不同长度的序列（可在不同位置终止复制），接下来的三份样品同理。最终就能得到长度不同，终端已知的DNA序列。然后通过凝胶电泳和放射自显影确定DNA序列。

2. 一二三代测序大概介绍

• 第一代测序：通量低，准确度高，读长1000bp左右，依然作为许多文献测序金标准

• 第二代测序NGS：主要分为两种测序平台，Illumina测序（reads中等，通量较高，价格最低，但测序质量较差）及454测序（reads较长，较准确，通量较低，成本偏高），Illumina是在Sanger法基础上，边测序变合成，即用4中不同颜色荧光标记的dNTP，当NA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

• 第三代测序（Single Molecule Real Tme DNA Sequencing）:单分子实时DNA测序技术，基于纳米孔的单分子读取计数，无需扩增可快速读取序列。读长非常高，测序速度快，准确度非常高，可直接检测广泛的碱基修饰。

3. 第二代测序技术大体流程

• 建立DNA文库：利用超声波把DNA样本打断成200-500bp长的序列片段，同时在其两端加上不同adapter(接头)，构建出单链DNA文库
• Flowcell：建立好文库后，文库DNA通过flowcell时会随机附着在其表面的泳道上，且泳道表面有许多接头，能与文库DNA接头相互配对，支持DNA在表面进行桥式PCR扩增

• 桥式PCR扩增与变形： 桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增，如图4.a所示。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。

• 测序：变合成边测序。

  
  测序.png