生信分析加组织验证，从细胞层面识别肿瘤亚型
A Tuft Cell-Like Signature Is Highly Prevalent in Thymic Squamous Cell Carcinoma and Delineates New Molecular Subsets Among the Major Lung Cancer Histotypes
胸腺鳞状细胞癌中高度流行一种类似于Tuft细胞的特征，并在主要的肺癌组织型中划分出新的分子亚型
发表期刊：J THORAC ONCOL
发表日期：2021 Feb 17
影响因子：13.357
DOI: 10.1016/j.jtho.2021.02.008
一、研究背景
胸腺上皮瘤（TETs）包括胸腺瘤和侵袭性较强的胸腺癌（TCs）。胸腺瘤根据新生上皮细胞的组织形态和未成熟T细胞的比例，可分为A型、AB型、B1型、B2型、B3型和其他罕见类型。TCs的分化程度不一，但胸腺鳞状细胞癌（TSQCCs）约占80%的病例。由于它们的罕见性和代表性细胞系的匮乏，现阶段对TETs的生物学认识不足。手术以外的治疗仍然主要是经验性的，有效的长期治疗方案是不可用的。
二、材料与方法
1 数据来源
1）TCGA：胸腺瘤（也包括TC）（N = 117，包括A型(N = 10)、AB型(N = 48)、B1型(N = 12)、B2型(N = 25)、B3型(N = 10)、微结节胸腺瘤(N = 2)和TCs(N = 10)），肺SQCC和肺腺癌。
2）GSE57892：包含22例TETs型A(N = 5)、AB(N = 2)、B2(N = 3)和B3胸腺瘤(N = 5)和TC(N = 7)
3）George等人提供的66例肺LCNECs
4）RT-qPCR：60个速冻的TETs病例
5）免疫组化的分析：该队列包括胸腺瘤、胸腺和非胸腺SQCCs以及神经内分泌肿瘤（NENs）
2 分析流程
1）RT-qPCR、IHC、Western Blotting
2）统计分析：Wilcoxon检验、Student's t检验、chi-square检验、Fisher's exact检验、无监督聚类、富集分析、生存分析
3）胸腺滤泡细胞表达试剂盒：根据最近发表的小鼠胸腺上皮细胞（TEC）亚集（GSE114651）的基因表达标志，16 KIT，人TC标记的小鼠同源物KIT的mRNA表达水平在小鼠胸腺Tuft细胞中高于其他mTEC亚集和皮质TECs。这一发现促使作者调查已发表的人类胸腺瘤和TCs的基因表达数据集，以获得Tuft细胞标记物。
三、结果展示
01 - TCs在mRNA水平上表达胸腺滤泡细胞相关基因
搜索TCGA 数据集的胸腺瘤和TCs的24个基因的mRNA表达水平，这些基因在正常的小鼠胸腺Tuft细胞中特征性地表达，但不在其他正常TEC亚集，作者发现TCs经常表达这些基因。
POU2F3，Tuft细胞的主调节器，和ALOX5，GFI1B，CHAT和L1CAM的表达水平显著高于TCs比A型（CHAT除外），AB和B1-3胸腺瘤（图1）。通常局限于正常皮质TEC和非tuft细胞mTEC亚群15的基因在TC中的表达与胸腺瘤相比没有显著升高（补充图3A）。在Petrini等人提供的独立TET数据集中也观察到TC中Tuft细胞标志物的上调（补充图3B）。最后，在60个速冻TET队列中，RT-qPCR分析证实，两个关键的Tuft细胞标志物POU2F3和GFI1B的表达水平在TCs中显著高于A型、AB型、B1型、B2型和B3型胸腺瘤（图2A）。
图1 胸腺上皮肿瘤中24个胸腺Tuft细胞相关基因的mRNA表达
补充图3 胸腺上皮肿瘤的mRNA表达谱
图2 POU2F3和GFI1B在TETs中的mRNA表达水平以及TETs和非TETs的IHC结果（作者的肿瘤队列）
02 - TSQCCs普遍表达关键的Tuft细胞蛋白，POU2F3和GFI1B
124例福尔马林固定、石蜡包埋的TET（包括上述速冻病例中的部分（60例中的7例））的IHC显示，虽然阳性细胞的比例不一（图2C），但几乎所有的胸腺瘤和胸腺NENs都是阴性的，但约70%的TSQCC中都有POU2F3蛋白表达（图2B）。同样，GFI1B的表达在TSQCC和其他TET亚型之间有显著差异，但GFI1B阳性TSQCC的比例低于POU2F3阳性TSQCC。POU2F3和GFI1B的IHC也成功标记了胰腺中的正常Tuft细胞。
与TSQCC相反，来自其他器官的SQCCs和NENs通过IHC呈POU2F3阴性。值得关注的是，皮肤SQCCs也是POU2F3阴性，尽管POU2F3在正常角质细胞中表达（图2B）。
03 - Tuft细胞样和非Tuft细胞样的TSQCCs代表不同的子集
作者的TSQCC病例中共有30%，TCGA联盟和Petrini等的队列中也有类似数量的病例表现出非Tuft细胞样表型（图3A和补充图3B）。对所有胸腺瘤和TSQCC的全局基因表达谱进行分层聚类，发现所有的Tuft细胞样TC都聚成一个组，虽然非Tuft细胞样TC分散在胸腺瘤中（图3B）。在驱动基因突变和临床发现方面，两组的规模太小，无法得出有意义的结论（补充图5A和B）。相比之下，TC中最常见的染色体异常--16q的丢失，在所有的Tuft细胞样TC中观察到，但在TCGA和Petrini等的联合队列中的非Tuft细胞样TC中都没有（图3A和补充图5D）。
图3 Tuft细胞型和非Tuft细胞型胸腺癌的分析（胸腺瘤、TCGA、PanCancer Atlas）
补充图5 Tuft细胞样和非Tuft细胞样胸腺癌的分析
04 - TC的Tuft细胞样表型与KIT的表达密切相关
比较POU2F3和GFI1B的mRNA表达水平和TSQCCs的经典诊断标记基因、KIT和CD5，在作者和Petrini等的队列中，这两个Tuft生细胞标记物与KIT和CD5的水平有中等至强的相关性，但在TCGA数据集中的相关性较低。此外，在TCGA和Petrini等以及作者的队列中，Tuft细胞标志物和KIT表达的相关性始终很高，且强于Tuft细胞标志物和CD5之间的相关性（补充图5C、5E和6A）。
在蛋白质水平上，从免疫组化队列中随机选择的24个TSQCC中，有12个共表达POU2F3、KIT和CD5，所有POU2F3阳性的病例(N＝17)均表达KIT，尽管12个也是CD5阳性(补充图6B和C)。总之，KIT的表达与TCs的Tuft细胞样表型的相关性比CD5的表达更强。
补充图6 Tuft细胞样和非Tuft细胞样胸腺癌的分析（作者的队列）
05 - 一种类似于Tuft细胞的特征和KIT的表达表征了NSCLC的子集
接下来对肺癌的TCGA数据进行分析，寻找簇细胞样mRNA信号。在TET结果的基础上，经验性地定义簇细胞样肿瘤为POU2F3和GFI1B的mRNA表达z得分均大于2（因此称为POU2F3和GFI1B共表达者）。
来自TCGA队列的484个肺SQCCs中，共有9个是POU2F3和GFI1B共表达者，这个子集不仅发现其他Tuft细胞标志物上调，而且还发现KIT上调（图4A和补充图7A）。对全局基因表达谱进行分层聚类发现，9个簇细胞样肺SQCC中的8个聚成一个组，表明它们形成了一个独特的亚型（图4A）。
利用基因本体富集分析，发现与细胞核相关的转录本，尤其是转录因子，在丛生细胞样肺SQCCs中显著富集（图4B），强调它们在转录本水平上与非丛生细胞样肺SQCCs不同。在基因水平上，RB1失活突变在tuft细胞样亚组中显著更常见，尽管TP53突变在两个亚组中同样分布（图4C和补充图7B）。
分析TCGA数据集提供的虚拟组织学切片，簇细胞样肺SQCCs的分化普遍比非簇细胞样病例差，9例中仅有3例表现为局灶性角化（补充图7D）。在临床上，女性和重度吸烟者在tuft细胞样肺SQCCs中的比例过高（图4D）。虽然在TCGA队列中发现簇细胞样肺SQCCs的阶段明显较低，但没有发现显著的生存差异（图4D和补充图7D）。
在510个TCGA肺腺癌中，有3个是Tuft细胞样肿瘤，与它们的SQCC对应物相似，它们表达KIT，聚集在一起(补充图7E)，显示RB1拼接突变或深度缺失以及TP53突变(补充图7F)，并且在组织学上分化较差(补充图7G)。事实上，在对合并的肺SQCCs和腺癌的TCGA数据集进行层次聚类分析时，两个队列的丛细胞样子集聚成一个组，表明它们的肿瘤生物学相似（图4E）。
图4 Tuft细胞样肺SQCC和腺癌（TCGA）的mRNA表达、遗传学特征和临床发现
补充图7Tuft细胞样和非Tuft细胞样肺鳞状细胞癌（SQCCs）和腺癌的分析（TCGA）
分析了George等人提供的数据集，根据mRNA表达的绝对值确定了12个POU2F3和GFI1B共表达者和54个非簇细胞样病例（图5A）。前者显著共表达其他簇细胞制造者和KIT，12例中有8例在基因表达分析上聚成一个小群(图5A)。与之前对SCLC的研究一致，19例簇细胞样LCNECs不表达Rudin等提出的其他3个POU2F3阴性SCLC亚组的主转录因子，神经内分泌标志物CHGA和SYP的表达水平明显低于非簇细胞样LCNECs（图5B）。
与簇细胞样肺SQCC和腺癌相似，簇细胞样肺LCNEC常有TP53和RB1突变，且RB1突变频率明显高于非簇细胞样队列。此外，LCNEC整体典型的STK11热点突变，在所有簇细胞样LCNEC中都不存在（图5C）。尽管存在这些分子差异，但两组之间的临床特征并无不同（图5D）。
图5 George等人提供的LCNEC的队列分析
四、结论
本研究中，作者报告了tuft细胞相关基因，特别是POU2F3和GFI1B，在大多数TSQCCs中高表达。此外，肺鳞状细胞癌(SQCC)、腺癌和大细胞神经内分泌癌(LCNECs)等较小的子集也表达了类似tuft细胞的特征。总之，tuft细胞样表型确定了TSQCCs的一个新的亚组和不同的肺癌类型，具有不同的分子和病理特征。这种特征伴随着独特的临床、组织学和遗传学特征，表明它在各自的癌症类型中划分了生物学上相关的子集。
