【干货】定量PCR科学加样流程

很多做用△△ct法做基因表达分析的“科研菜鸟”们，面临着数据不好的烦恼，典型烦恼如下：

1. 三个技术重复的△ct始终在0.5以上，而“高手”控制在0.2左右。

注：国际MIQE规范要求我们必须控制在0.5以内，否则数据不能用。

2. 目的基因和内参的基因的△ct不准确，而“高手”控制的如此完美。

注：△△ct法相对定量的原理基础是内参基因和目的基因的扩增效率一致，并接近100%。

于是乎，快速成为传说中的“定量PCR高手”，是“科研菜鸟”们的梦想。

图片来源网络，侵删

告诉各位“科研菜鸟”们一个惊天的秘密，造就“定量PCR高手”并不是勤学苦练，谨慎小心地做定量PCR，而是，高手都有“葵花宝典”之武林秘笈。

图片来源网络，侵删

今天，小编就为你分享造就定量PCR完美数据的“武林秘笈”。

造就定量PCR完美数据秘诀：

“两分法”科学加样流程设计。

“两分法”基本概念：

“两分法”思路是指把△△ct相对定量法两大关键因素“不同模板”和“不同基因”拆分两种不同部分进行设计“总管分装式”加样。

“不同模板”：是指不同cDNA模板，包括标准曲线中稀释的不同cDNA模板、相对定量△△ct中不同实验组或对照组的模板。

“不同基因”：指不同引物对，每对引物所代表的是一个基因包括内参基因或目的基因。

“两分法”加样设计：

  以QST-100系列定量PCR试剂盒为例的“两分法“加样设计原理（图一所示）：

图一

很多“菜鸟们”总喜欢把cDNA（例：2ul）单独加样，这是“师兄师姐经验”及“某些不专业公司”的误导！！！

因定量PCR非常灵敏，cDNA添加量的误差对ct值影响很大。所以“两分法”设计要求：凡是加同样cDNA模板孔总量和总的SYBR Green qPCR Mix总量充分混合在一起，然后分装12ul加样。这样使得cDNA加样误差降低到原来的1/6，也就是2ul/12ul。

上下游引物先充分预混为引物对Mix，然后把加同样引物对Mix的总量和水的总量充分混合在一起，然后分装8ul加样。这样使得引物加样误差降低到单独加引物的1/5,也就是也就是1.6ul/8ul。

“两分法”加样设计图：

“总模板管“加样分装设计图（图二所示）：

图二

如图二，8个样品，每样品cDNA液配一管，再分8次加样，要考虑都损失多加10%的量。“总模板管”成分计算：

 （1）每种cDNA量: 2ul×9孔×1.1=19.8ul

 （2）qPCR Mix量: 10ul×9孔×1.1=99ul

将cDNA19.8ul加入到99ul qPCR Mix中，配成总管；移液器吹打30次混匀。取12ul分装到qPCR管或板中。

“总引物管“加样分装设计图（图三所示）：

图三

3对引物，每对引物Mix配一管，再分3次加样，要考虑都损失多加10%的量。“总引物管”成分计算：

（1）每种引物量:1.6ul×26孔×1.1=45.76ul

（2）无RNase水量:6.4ul×26孔×1.1=183.04ul

将上下游引物Mix 45.76ul加入到183.04ul无RNase水中，配成总管；吹打20次混匀。取8ul分装到qPCR管或板中。

“两分法”总管分装加样设计，保证了“同一模板”孔cDNA添加量达到最小误差，也保证了“同一基因”孔引物对添加量保持到最小误差，从而让你的技术重复孔SD值最小和△ct更为准确。

哈哈，服不服？是不是得到了造就定量PCR完美数据的“武林秘笈”的感觉？

来源：Thomas toroivd