实验复盘（四）-----建库，需要注意的！

在假期的小总结，好好努力学(ban)习(zhuan)!!!!
今天这个总结，就是来关注在测序的建库实验！
（拖了非常久的一篇总结了。。。。。）
其实建库非常重要，如果一个文库建不好的话，后续的测序结果直接gg，能够得到的有用信息大打折扣！

ps:虽然现在建库属于常规操作，而且要是想省事的话可以把样品交给公司了。但是涉及到一些比较珍贵的或者是非常规样本，咱还是得掌握这个技术，自己动手去做实验不是~

  目前主流的二代测序方法有PE150,PE50等，那么如果文库的片段长度太长，会造成测序的浪费。

（举个小例子：对于PE150来说，双端能各测150bp，能测到的长度为300bp, 如果片段大小比较大，比如1kb，那么中间会有一大部分测不到，信息会被浪费。）

  想一想：为啥这个的二代测序的长度不能再长一些呢？有什么局限或者是问题吗？

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我们来看一下，符合上机要求的DNA文库长啥样：

illumia测序文库

我们能看到除了插入片段以外，有P5,P7,Rd1 SP,Rd2 SP Index 这些都是什么呢？

  我们来接着一步步来看~

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说到建库的步骤，已经有很多的大神写的非常的到位了，我们可以直接看一个流程图：

建库的基本流程

Part 1

Q:如果片段比较大，我们如何去让片段变小到合适的长度呢？

一：超声
二：限制性内切酶（需要特定的酶和位点）
三：转座酶

Part 2

Q：片段化后的DNA会变成啥样？

总共可能会有3种情况：

DNA片段化后的3种情况

这种片段化后的DNA除了平末端，是需要进行末端修复的。

Q：问题来了，如何进行末端修复呢？什么方法呢？

一般是用末端修复酶:(NEB 有 end repair mix )
  DNA聚合酶 I(Klenow 大片段):切除3'突出端和补平5'突出端的

  Klenow Fragment Exo-保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'和3'→5'外切酶活性。

  T4 DNA聚合酶在5´→3´方向上催化DNA的合成，需要模板和引物的存在。 此酶具有3´→5´核酸外切酶活性，比DNA聚合酶I（大肠杆菌）中的酶具有更高的活性。T4 DNA聚合酶不具有5´→3´核酸外切酶功能

看末端的情况，然后选择酶进行补齐

Q：末端补齐就该加A，用什么加？

   Klenow Fragment Exo-

加A

注意使用的温度！

（后续有想到啥再补充！）
欢迎各位大佬批评指正~