2020-11-05 如何判定荧光定量结果的真实性？
如果你说的是荧光定量PCR的话：
根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。
典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。
根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。
在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。
定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。
1.终点定量不准确
理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是
S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA
模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的
Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR
反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大【1】。
传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷贝数，经过PCR扩增以后的DNA拷贝数已经不能反映真实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据CT值确定DNA起始拷贝的数量。
- CT****值与起始模板拷贝数成线性关系
CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。重复实验中可以直观地看到，尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。如果用不同浓度的DNA作PCR，可以看出DNA浓度越高，CT值越小。DNA浓度每增加1倍，CT值减小1个循环。CT值与模板DNA的起始拷贝数成反比.
其数学证明为：
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既第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB) 加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS) 与分子数目的乘积，，[图片上传失败...(image-7092cc-1604554520788)]
是初始目标分子数，[图片上传失败...(image-674bf1-1604554520788)]
是目标分子扩增效率,[图片上传失败...(image-4d9a7d-1604554520788)]
是循环数，[图片上传失败...(image-fe2b9c-1604554520788)]
代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。
当循环次数[图片上传失败...(image-325753-1604554520788)]
时,[图片上传失败...(image-e6a7d0-1604554520788)]
两边取对数，得[图片上传失败...(image-2c921d-1604554520788)]
;
整理得：[图片上传失败...(image-8358fb-1604554520788)]
由上可得，对于每一个特定的PCR反应来说，[图片上传失败...(image-2d91bc-1604554520788)]
、[图片上传失败...(image-714e13-1604554520788)]
、[图片上传失败...(image-494aef-1604554520788)]
和[图片上传失败...(image-a17ec6-1604554520788)]
都是常数，所以[图片上传失败...(image-542516-1604554520788)]
值与[图片上传失败...(image-e7370a-1604554520788)]
成反比，也就是说，[图片上传失败...(image-fee4c0-1604554520788)]
值与起始模板拷贝数([图片上传失败...(image-7d5a49-1604554520788)]
)的对数成反比。
3.数据分析的几个概念【2】：
基线（Baseline）:扩增曲线中的水平部分；
调整原则：如果CT值>18，不需调整，使用自动分析结果；如果CT<18，修改终点，再分析一次；起点一般取3-6，终点一般取12-15.
阈值线（Threshhold）：荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。
手动调节阈值线的原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值.
4.数据分析三部曲
①曲线分析（Amplification Plot）：
该步骤主要是对扩增曲线进行整体或单个的调整，主要包括：对数曲线与线性曲线的转换、模板或内标检测探针的选择、基线的调整、阈值的设定等几个方面。
主要有整体曲线的观察：分析是否存在污染（主要是试剂污染）；分析是否有因物理或其他因素造 成的异常曲线情况；
阴性对照分析：观察是否存在污染；
阳性对照分析：观察是否在质控范围内；
标准品分析：观察标准品分布是否均匀，梯度是否正常，Ct值是否正常。
②标准曲线分析（Standard Curve）
该面板主要用于标准曲线参数的分析，通过对曲线各个参数的统计，可以判断实验定量的准确程度或者试剂的稳定程度。其主要包括三个参数：Slope（斜率）、Intercept（截距）和R2（线性相关性）。
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上图为外标定量方法原理图。
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。
标准品与待测样本的扩增效率一致。 Log(浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中的起始模板量。
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
Intercept（截距）：不同公司的试剂截距有很大的不同，主要是指只有1个病毒扩增时，曲线出现的Ct值。
R2（线性相关性）：指示本次实验标准品的线性关系。
注：优质试剂的标准品每次实验的参数是比较稳定的，做质控分析后偏差应在±2SD范围内，Ct值变异系数应小于10%。
③定值浓度或Ct值：
通过上述步骤分析后，可以得到一个比较准确的定量结果或Ct值，如果在上述步骤中没有记录到异常曲线或者情况，则可以发出正确的报告，对于异常的曲线或者情况，则需单独分析，确定重复实验的必要性。
参考文献
【1】《实时荧光定量PCR原理和实验》，陈云地，美国应用生物系统公司；
【2】《实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告》，周向阳，广西临床检验中心；
侵删。
