项目文章JEV（IF 21.224）| 外泌体内容物新发现！ln
lncRNAs是一类长度大于200个碱基且不编码蛋白的RNAs转录本。实验表明， lncRNAs中的小开放阅读框可以编码多肽，即微蛋白。微蛋白在细胞稳态、代谢和发育、应激信号传导和DNA修复等过程中发挥作用，也会影响肿瘤的发生、侵袭和转移过程，但微蛋白的作用机制尚不清楚。
2021年7月中科院生物物理所杨福全研究员团队、陈润生院士团队及北京三博脑科医院张宏伟教授合作在Journal of Extracellular Vesicles（IF 21.224）杂志上发表题目为 《LncRNA-encoded microproteins: A new form of cargo in cell culture-derived and circulating extracellular vesicles》的研究成果，利用蛋白组学、免疫共沉淀-质谱法技术揭示胶质瘤细胞衍生的外泌体中的微蛋白转移可能代表了细胞间通讯的新机制。中科新生命在本次研究中提供了外泌体表征服务。
【研究材料】
细胞和人血浆外泌体
【实验分组】
蛋白组学、免疫共沉淀-质谱法(Co IP-MS)、RT-PCR和免疫共沉淀
实验方法
步骤1：lncRNA编码的微蛋白理论数据库构建；
步骤2：细胞衍生外泌体的提取和微蛋白鉴定及验证；
步骤3：蛋白质组学揭示外泌体中微蛋白的潜在功能；
步骤4：血浆外泌体中的微蛋白鉴定及验证。
研究结果
1. lncRNA编码的微蛋白理论数据库构建
为在胶质瘤细胞及衍生的外泌体中鉴定更多的新的微蛋白，作者优化了基于质谱的微蛋白分析流程，并构建了人类理论微蛋白数据库。最近报道的功能微蛋白都可以在该数据库中找到，验证了该数据库的高质量和全面性。
图1 lncRNA编码的微蛋白的鉴定流程
2.胶质瘤细胞及其衍生外泌体中的微蛋白鉴定
为鉴定胶质瘤细胞及衍生的外泌体中新的微蛋白，作者提取了胶质瘤细胞衍生的外泌体，通过透射电子显微镜（TEM）和标记蛋白（CD9，CD63，CD81和Alix）的WB实验验证外泌体的纯度，利用纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定颗粒浓度和粒径分布。利用TMT标记蛋白组技术在胶质瘤细胞和衍生的外泌体中分别鉴定到了84个和29个微蛋白，其中9个微蛋白是共有的。鉴定的大多数微蛋白长度小于100个氨基酸，最短的20个氨基酸。鉴定出的微蛋白中，只有不到15%是从AUG密码子启始的，32%的微蛋白起始密码子相近，而大多数微蛋白的起始密码子未知。为确定微蛋白的进化保守性，作者对多个物种基因组进行同源比对，发现灵长类动物中微蛋白有一半以上也存在于啮齿类动物中。
图2 胶质瘤细胞及衍生的外泌体微蛋白
3.细胞及衍生的外泌体微蛋白验证
为验证编码微蛋白的lncRNAs在胶质瘤细胞中是否表达，作者从胶质瘤细胞中提取核糖体，用RT-PCR检测单体和多聚体相关的lncRNAs，发现8个测试的lncRNA都与核糖体相关，其中7个与核糖体结合的lncRNA的含量明显高于游离的，表明lncRNA处于活跃翻译的状态。
为研究微蛋白115127的小开放阅读框（smORF）是否具有翻译活性，作者构建了融合表达载体115127-GFP，发现115127-GFP融合蛋白大量表达，用WB实验证实115127-GFP融合蛋白大小与预测的分子量一致，进一步利用质谱分析了GFP抗体富集的沉淀蛋白，确证了微蛋白115127的存在，这些结果表明微蛋白115127的smORF具有翻译活性。为了进一步验证微蛋白是否能被包装到外泌体中，作者构建了115127-FLAG融合载体，从转染的细胞中收集外泌体，利用免疫荧光染色和WB检测到115127-FLAG融合蛋白大量表达，115127-FLAG大小与预测的分子量一致，这表明微蛋白115127可以被分选到外泌体中。为研究微蛋白115127的潜在功能，作者利用免疫共沉淀-质谱法(Co IP-MS)分析115127-GFP的相互作用蛋白，发现与氧化还原应激相关的蛋白PrDX1、PrDX2、PrDX4及MAPK1和XPO1等显著上调，且这些蛋白质可以形成PPI网络，由此推测微蛋白115127可能参与了氧化还原应激过程。
图3 细胞及衍生的外泌体中微蛋白的验证
4.血浆外泌体中微蛋白的鉴定
为鉴定人血浆中的微蛋白，作者利用蛋白质组学分别鉴定了三名健康人和三名胶质瘤患者血浆外泌体的微蛋白、以及健康人的血浆和无外泌体的血浆微蛋白，发现健康人血浆外泌体中包含48种微蛋白，高于血浆和无外泌体血浆微蛋白数量，这可能与外泌体的保护作用有关。在胶质瘤患者的血浆EVS中发现64个微蛋白，大多数微蛋白的长度都在100个氨基酸左右。作者进一步使用合成肽对鉴定到的微蛋白进行了靶向蛋白组验证，选择的13个微蛋白中有12个成功匹配，说明微蛋白鉴定的准确性非常高。利用主成分分析发现健康人与胶质瘤患者明显分开，表明血浆外泌体中的微蛋白含量存在明显差异，是潜在的有价值的标志物。
图4 血浆外泌体中的微蛋白
小编小结
本研究首次发现并证明了在细胞和血浆外泌体中存在丰富的微蛋白，通过免疫共沉淀-蛋白组学技术找到了外泌体微蛋白的互作功能蛋白，揭示其可能参与了胶质瘤细胞中的氧化还原应激过程。此外，本研究还发现健康人和胶质瘤患者的血浆外泌体微蛋白存在差异，可以作为潜在的诊断和预后标志物，为其临床应用开发奠定了基础。
