2023-10-30 CRISPR-cas9 脱靶检测流程

2023-10-29 本文已影响0人 JL笔记

脱靶位点预测
1.1 登陆 http://www.rgenome.net/cas-offinder/ 网站，输入靶点序列，自动预测易脱靶位点。
1.2 本次参数:SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3';Sus scrofa (susScr11) - Pig;Mismatch Number 4;DNA Bulge Size 2;RNA Bulge Size 2。
数据筛选与整理
2.1 下载数据后使用excel工具打开并进行筛选，筛选条件根据自己要求自己设定，本次设定：Mismatch Number 1;Bulge Size 2
2.2 根据position位置整理信息，三列：chr position+300 position-300
序列抓取
3.1 登录 https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/susScr11/bigZips/ 网站，下载猪的基因组序列。
3.2 解压数据，使用tbtools工具（Fasta Extract（Recommended））进行序列提取，input放入基因组序列，out设置输出位置和名字，idlist输入2.2整理信息，start
引物设计
将3.2获得的序列信息整理到word中，使用bioXM工具辅助设计引物。
PCR扩增、检测、测序
使用上步设计的引物进行扩增，电泳检测后送公司进行测序。
测序结果分析
在NCBI网站上进行BLAST，使用默认nr DB，查看是否比对到相关基因，若比对到基因，则将比对到的参考序列与靶点序列比较，查看是否脱靶。