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• DOI: 10.1128/mSystems.00271-18

重要内容：
1 通过高通量测序和生物信息学分析(9,-11) ，肠道微生物组的研究已经被赋予了一种独立于培养的方式。
2 本研究种的亮点：
在这项研究中，评估了六种保存液(Norgen，OMNI，RNAlater，CURNA，HEMA 和 Shield)在这些方面的性能。用这些防腐剂在室温下保存人粪便样品7天后，对细菌16S rRNA 基因的3个高变区(V1-V2，V3-V4和 V4)进行幅度测序。

重要发现：采用 Norgen 和 OMNI 两种防腐剂的样品，相对于 -80 ° c 的标准，群落组成的变化最小，并且都能有效地抑制好氧和厌氧细菌的生长。

RNAlater 并不能阻止细菌的活性，而且表现出相对较大的群落变化。

虽然保存液的效果比受试者之间的变化小，但观察到微生物群组成的显著变化，这可能造成下游数据分析的偏差。通过比较不同16S rRNA 基因高变区的群落特征，发现引物组合在鉴定微生物群落和某些细菌类群时具有不同的敏感性。

例如，V4引物对产生的读数显示肠道微生物群落的 alpha 多样性更高。

退化的27f-YM 引物未能检测到大多数双歧杆菌目。我们的数据表明，保存液的选择和16S rRNA 基因的引物对是影响肠道微生物群分布的关键决定因素。

冻存 的意义：立即将粪便样品冷冻在摄氏零下20度或以下被认为是防止微生物群落组成发生变化的”黄金标准”（Methods for Improving Human Gut Microbiome Data by Reducing Variability through Sample Processing and Storage of Stool.
Gorzelak MA, Gill SK, Tasnim N, Ahmadi-Vand Z, Jay M, Gibson DL PLoS One. 2015; 10(8):e0134802.）

在没有可靠的冷链运输的偏远地区，或者在要求受试者在环境温度下将自己收集的家庭样本送往实验室的研究中，这种方法是不可行的。比较了几种贮藏条件对揭示微生物群组成的影响，并将其与在 -80 °c 即刻冷冻进行了比较。

常用的保藏粪便样品的方法：
a 例如，在室温下保存至多1天的粪便样本，或在4 ° c 和 -20 ° c 保存至多2周的粪便样本，对微生物群组成的变化几乎没有影响(13,-15)。

b 然而，当样品暴露于室温或超低温冷冻以外的更高温度时，使用保存方法就变得至关重要和关键。

c 在浓度为95% 或更高的乙醇中保存细菌 DNA 以便长期储存(15) ，但是另一项研究报告低 DNA 产量是使用乙醇的一个潜在缺点(16)。

d 此外，根据当地的交通规则，自行采集的用乙醇稳定的家庭样本(70% 以上)可能需要特殊的运输。

d RNA 水解酶，通常用作 RNA 样品的防腐剂，已被证明降低了 DNA 的纯度，并且在维持16S rRNA 基因幅图测序(16,17)所得到的微生物群组成方面表现相对较差。

f 含有 EDTA 的缓冲液可以抑制某些细菌的生长，但是它们显著地影响肠道微生物群的组成，例如 Bacteroides 和变形菌的丰度增加和厚壁菌和放线菌的减少。

g OMNIgene.肠道是一种商业上可用的在环境温度下保存粪便样本的方法，最近有报道称，肠道生成的群落剖面偏离 -80 °c 标准最小

整体实验设计：
**保藏方法：多位点大规模纵向微生物群研究方案开发的一部分，我们评估了六种防腐剂溶液(Norgen、 OMNI、 RNAlater、 CURNA、 HEMA 和 Shield)在保留肠道微生物群组成方面的效果，并与在 -80 ° c 即刻冷冻相比较。

**粪便样品来源： 收集了五名健康人的粪便样本，并将其储存在不同的保存液中7天，这段时间通常足以邮寄到实验室。

**测序片段区域： 对细菌16S rRNA 基因 V1-V2、 V3-V4和 V4的3个高变区进行扩增测序。采用标准好氧培养和厌氧培养评价这些防腐剂的杀菌能力。

流程图：

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实验方法：五个健康人提供了新鲜的粪便样本(图1; 另见补充材料中表 S1)。对于每个受试者，其中一组样品立即在 -80 °c 下冷冻，8个样品分别储存在不同的溶液中，包括6种防腐剂(Norgen、 OMNI、 RNAlater、 CURNA、 HEMA 和 Shield)、磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)和 Cary-Blair (CB)输送介质(表1)。在室温条件下保存7天后，所有样品均在 -80 °c 条件下保存，不进行冻融循环，直至 DNA 提取。通过靶向细菌16S rRNA 基因(V1-V2，V3-V4，V4)的三个高变区(表2) ，在 Illumina MiSeq 平台上采用珠击法和 amplicon 测序提取总 DNA，包括 -80 ° c“金标准”(gold standards)。用于 PCR 扩增的 DNA 提取物的质量在受试者和防腐剂之间没有明显的差异，在具有相似条带亮度的琼脂糖凝胶上观察到(数据未显示)。

测序及分析：
我们首先使用代表16S rRNA 基因 V3-V4区域的序列来评估肠道微生物群谱，因为这个区域提供了最长的读长度(表2)。共获得45个样本的121,532个高质量序列读数(平均 SD 为2,700 ± 667) ，聚类为308个幅相序列变异(ASVs)。这些 ASVs 代表了105个属或更高水平的细菌类群，而64个在至少一个样品中检测到≥1% 的相对丰度。按顺序分配的肠道微生物群落如图2A 所示。正如预期的那样，未保存在 PBS (8_pbs)和 Cary-Blair 运输培养基(9_cb)中的粪便样品在室温下保存7天后，其微生物群组成与 -80 ° c 标准和保存菌群(样品1至7)相比有显著变化，这是用加权或不加权 UniFrac 距离进行主坐标分析(PCoA)所区分的(图2B 和 c)。C).然而，使用 r’ s Vegan 包装中的 Adonis 函数，基于加权 UniFrac 距离(df = 2，R2 = 0.504，pseudo-F = 21.346，p < 0.001)的完全方差多变量分析(PERMANOVA)发现微生物群落组成的变异性高于未加权 UniFrac 距离(df = 2，R2 = 0.093，pseudo-F = 2.160，p < 0.01) ，表明样本群集更多地是由微生物群落成员的比例而不是细菌种类的存在/缺失所驱动的。例如，在未保存的肠道样本中，Enterobacteriales (图2 d)和 Fusobacteriales (图2 e)的相对丰度显著增加，而梭状芽孢杆菌目(图2 f)和 Betaproteobacteriales (图2 g)则减少(表 s 2)。

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16S rRNA 基因 V3-V4幅度测序观察 PBS 和 Cary-Blair 转运培养基中未保存粪便标本的群落变化。(a)显示细菌数量比例的条形图。红色和蓝色的填充三角形分别代表 PBS 中未保存的样品(样品8)和 Cary-Blair 传输介质(样品9)。细菌类杆菌目包括科氏杆菌目、 Desulfovibrionales、 Pasteurellales、 Synergistales、 Victivallales 和 Bacillales。(b)加权 UniFrac 距离的主坐标图区分不同防腐剂的未保存粪便样本与其他粪便样本(表1列出样本1至7的详细保存方法)。(c) unweightedunifrac 距离的主坐标图区分不同防腐剂中未保存粪便样本与其他粪便样本。(d 至 g)两组 Tukey HSD 即兴测试结果显示，在未保存的粪便样本中，Enterobacteriales 和梭杆菌目的相对丰度增加，而 Clostridiales 和 Betaproteobacteriales 的相对丰度则减少。

其次，我们修订了 ASV 表，剔除了 PBS 溶液和 Cary-Blair 转运培养基中的样本，以在零下80摄氏度即时冷冻作为标准，测量保留肠道菌群组成的六种防腐剂的变化。总的来说，粪便样本的微生物群落以粪便杆菌(平均相对丰度为23.4%)和拟杆菌(22.2%)为主，其次是粉刺菌(7.3%)(表 S3)。无论是 ASV 水平还是种属水平的 α 多样性分析，在 -80 ° c 标准和保存样品(图3A 和 b)、 b 之间均无显著差异，只是保存在盾牌中的矮子叶植物的 Shannon 多样性(平均3.0和2.2)和 Simpson 均匀度(平均0.9和0.8)相对较低。我们发现受试者肠道微生物群落的 α 多样性发生了显著变化(Kruskal-Wallis 试验，p < 0.029))。

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V1--V4区域：

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主要结果与结论：
微生物群研究已迅速转向大规模样本收集，以确定微生物群落中与人类健康和疾病有关的细微差异。

虽然在零下20摄氏度或以下立即冷冻被认为是微生物群保存的”黄金标准” ，但这种方法对许多研究来说并不可行，特别是对偏远地区的实地取样或需要运到实验室而不需要冷链运输的自采样品。

在这种情况下，一种适当的保存方法，尽量减少微生物群组成的变化，以减少偏见和灭活需要安全处理的样品的传染剂，就变得至关重要。

因此，我们评估了多种保存液和16S rRNA 基因高变区在揭示肠道微生物群组成方面的作用。我们的数据显示，在没有保存保护的情况下，在室温条件下，肠道微生物群的形态可以在7天内发生显著的变化。相比之下，在不使用冷链的情况下使用适当的防腐剂，可以令人满意地防止社区的变化。

这些防腐剂的影响是小的相比，主题之间的变化，然而，显着变化的微生物群组成观察。然而，我们发现两种防腐剂，Norgen 和 OMNI，表现出最小的微生物群落变化，并且都能有效地抑制需氧和厌氧细菌的生长，这表明它们可以作为有用的解决方案，为粪便样品的运输和储存。最近的研究表明，OMNIgene.GUT (简称 OMNI)能够在室温下稳定 DNA 长达14天，而16S rRNA 基因测序(13,15,19,21)对微生物群组成的影响不大。另一方面，RNA 样品常用的防腐剂 nalater 在室温下7天内细菌相对丰度发生较大的群落变化，这与以前的报道一致，即 nalater 中的微生物群落在室温下维持较长时间时可能失去稳定性(12,15,16,22)。然而，在低温条件下(如摄氏4度或 -20度)或短时间的室温贮存(如同一天或另一天) ，它的表现与其他贮存条件一样好，如95% 乙醇、 FTA 卡和 OMNIgene.GUT (21,23,24)。有趣的是，RNAlater 和 CURNA (含有与 RNAlater 相似的成分)并不能阻止细菌的活性，当需要活细菌培养时，它们是微生物样本采集的潜在替代品。根据制造商的说明，HEMA 最初是为了稳定棕色毛皮样品而开发的，以前没有报告评估 HEMA 作为微生物群研究样品的防腐剂的用途。盾牌在微生物区系保存和消毒方面表现良好，但无论选择哪一对16S rRNA 基因引物，粪便杆菌的相对丰度都持续增加。我们建议使用 Norgen 或 OMNI 作为微生物样品保存，并警告不要使用 RNAlater 在室温下长期保存。

重要结论：对于大规模的微生物组研究来说，准确和一致地揭示微生物群落同时尽量减少外部影响是很重要的。粪便样品室温运输保存液的选择和16S rRNA 基因幅度测序基因区域的选择是影响观察到的微生物群落图谱的关键决定因素。

---

我们建议使用适当的防腐剂，如诺根或 OMNI，可以最大限度地减少微生物群落的转变，有效地抑制细菌生长，使得最终的样品能够安全和稳定地处理和运输。基于幅度测序的人类微生物群研究高度依赖于针对细菌16S rRNA 基因不同高变区的引物对的选择。尽管如此，一个一致的方法对于最小化批处理偏差来促进数据集之间的比较是必不可少的。

QIME2 用的代码与方法：

The following pipelines are applicable to the 16S V3-V4 dataset. Only
key parameters for 16S V1-V2 and 16S V4 datasets are listed. All
demultiplexed paired-end fastq sequences and metadata are available
from SRA (PRJNA470603).
We used SILVA_132 99% reference database to train the feature
classifiers. The full-length sequences is available from SILVA website
(https://www.arb-silva.de/download/archive/qiime).

loading qiime2-2018.8 environment

source activate qiime2-2018.8

training 16S classifiers (SILVA_132_99)

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importing data

qiime tools import
--type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]'
--input-path /Folder_Containg_16SV3V4_Paired_End_Fastq/
--input-format CasavaOneEightSingleLanePerSampleDirFmt
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denoising 16S V3-V4 data using dada2

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make denovo phylogeny of OTUs

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exporting tree as a newick formatted file

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exporting OTU feature table

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collapsing feature tables by the taxonomy at the specific level (--

p-level 6==genus, 5==family, 4==order, 3==class, 2==phylum)
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exporting taxonomy

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exporting representative OTU sequences

qiime tools export
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extracting and training the SILVA V1-V2 classifier

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extracting and training the SILVA V4 classifier

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denoising 16S V1-V2 data using dada2

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denoising 16S V4 data using dada2

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merge data from different 16S regions using fragment insertion AKA

SEPP
qiime feature-table merge
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--o-placements insertion-placements.qza

Use ‘insertion-tree.qza’ for all downstream phylogenetic analysesPage 7 of 7

exiting qiime2-2018.8 environment

source deactivate qiime2-2018.8