FBW7通过端粒脱帽介导衰老和肺纤维化

导言

今天小编分享一篇2020年10月20日发表于Cell Metabolism的文章——FBW7 Mediates Senescence and Pulmonary Fibrosis through Telomere Uncapping（IF：21.567）。组织干细胞在压力下过早衰老会诱发与年龄相关的疾病，然而，相关的机制目前仍不清楚。文章报道了在对IR、H2O2或BLM的应激反应中，E3泛素连接酶FBW7通过端粒脱帽介导细胞衰老和组织纤维化。FBW7与端粒TPP1结合，促进TPP1多位点泛素化，加速降解，引发端粒脱帽和DNA损伤反应。过表达TPP1、干扰FBW7或拟肽端粒功能障碍抑制剂（TELODIN）可减少端粒的脱帽和缩短，扩大小鼠肺泡AEC2干细胞的数量。从FBW7的WD40螺旋结构域的第7个β链合成的TELODIN可提高TPP1的稳定性、增强肺呼吸功能以及长期处于压力环境下动物对衰老和纤维化的抵抗力。

结论

1.应激性肺衰老与纤维化由FBW7介导

2.FBW7诱导TPP1降解触发端粒脱帽和DNA损伤

3.FBW7-KO或过表达TPP1促进端粒加帽预防SIPS和纤维化

4.TELODIN阻断FBW7与TPP1的结合抵抗SIPS和纤维化

注：第4该点不做详细介绍，参看文末原文链接。

结果展示

FBW7介导应激性肺衰老和纤维化

结果表明，在气管内BLM（3U/kg）或IR（5 Gy）应激条件下，AEC2干细胞显著降低，而支气管肺泡干细胞（BASCs），Clara细胞，基底细胞（BCs）和远端气道干细胞（DASCs）保持不变。然后发现缺乏FBW7的AEC2干细胞在静息状态下显著增殖。将野生型（WT）小鼠暴露于BLM持续21天后显著增加AEC2干细胞中p16INK4a基因表达水平，这一作用在FBW7-KO小鼠中被废除。研究发现，FBW7-KO显著抑制BLM诱导Ki67+增殖性AEC2干细胞减少和HP1γ+衰老性AEC2干细胞增多作用。此外，FBW7-KO也能显著增强小鼠肺呼吸功能。进一步研究发现，FBW7-KO显著抑制BLM诱导WT小鼠肺衰老和纤维化。FBW7-KO显著升高细胞增殖基因水平，降低细胞周期抑制基因和a-SMA基因水平，同时抑制BLM诱导SPC的降低，并且在IR诱导的模型中也呈现一致的作用。

FBW7介导应激性肺衰老和纤维化

研究发现，端粒shelterin蛋白TPP1在H2O2、BLM或IR作用下快速降解。沉默不同的E3泛素连接酶揭示了应激诱导的依赖于FBW7的TPP1缺失。在三种FBW7亚型中，核FBW7α和γ可促进TPP1降解。此外，沉默FBW7可促进TPP1半衰期从5-6 h延长至15-18 h，而过表达FBW7加速TPP1的缺失。为了研究FBW7介导TPP1缺失的上游通路，沉默了40种核蛋白激酶并确定GSK3β在IR诱导TPP1降解中的作用，使用GSK3β选择性抑制剂CHIR99021和TC-G24阻断了FBW7α介导TPP1的降解。进一步研究发现，BLM刺激TPP1多泛素化，而过表达FBW7α可诱导TPP1多泛素化显著增加。通过对不同赖氨酸残基定点突变鉴定出在299、453和459处泛素化可使FBW7α介导的多泛素化总体降低30%。进一步研究发现，232K残基突变在过表达FBW7诱导的TPP1泛素化中显著增加。这些结果表明FBW7通过促进TPP1在299K、453K和459K残基的多泛素化来调节应激诱导的TPP1降解，受TPP1在232K残基泛素化调控。

COIP验证TPP1与FBW7α和γ的结合。FBW7α的WD40结构域中465R、479R或505R残基的单个氨基酸突变模拟人类癌症中的FBW7基因突变，使FBW7与TPP1的结合和降解失效。删除C-末端49个氨基酸（FBW7 1-658），而不是F-box，取消了FBW7α与TPP1的结合，而重组FBW7的WD40结构域（362-707）可直接与TPP1结合，这表明FBW7 C-末端49个氨基酸序列介导了FBW7与TPP1的结合。此外，删除TPP1丝氨酸/苏氨酸区域（341-482），包含预测的CPD位点，抑制TPP1与FBW7的WD40结构域的结合。同样地，对预测CPD位点的TPP1354S或358S残基进行突变抑制了TPP1与FBW7α的结合。结果表明FBW7的WD40结构域C-末端尾与含有磷酸化354S和358S残基的CPD结合在TPP1的丝氨酸/苏氨酸区域，介导TPP1在299K，453K和459K残基多位点多泛素化。

FBW7促进TPP1多位点泛素化和降解

IF-FISH结果显示，核FBW7和端粒以TPP1依赖的方式共定位于细胞。用特异性抗体和端粒DNA特异性探针进行斑点杂交显示，FBW7α或γ可以共沉淀端粒DNA。此外，Q-FISH显示在染色体末端无法检测到的端粒中过表达FBW7α或γ引起沉淀显著增加。在HeLa细胞中，过表达FBW7α或γ增加端粒脆性和融合，促进端粒功能障碍和端粒缩短。而非端粒DNA损伤发生在端粒缩短的染色体中，在没有端粒缩短的染色体中，端粒以外的损伤没有明显增加，这表明端粒的脱帽和缩短触发了非端粒DNA损伤。另外端粒DDR还伴随γH2AX的结合增加，p16和p21水平升高，c-Myc水平降低，细胞周期阻滞于G2/M期和HP1γ和β-Gal表达增加。这些结果表明FBW7可以触发端粒脱帽，导致端粒缩短以及随后的非端粒DNA损伤、DDR、G2/M期细胞周期停滞，以及随后的细胞衰老。

FBW7-KD显著抑制TIFs的水平，增加端粒长度。为了确定FBW7-KD是否能阻止应激诱导的端粒脱帽，检测了沉默FBW7和其他E3泛素蛋白连接酶后的TIFs水平。结果发现FBW7-KD是与连接酶中TIF基础水平降低相关的唯一条件，并且FBW7-KD消除了H2O2或IR诱导的TIF增加。与敲除其他E3泛素连接酶相比，RNF8 -KD显著增加TIF的基础水平，并增强H2O2或IR诱导的TIF增加。这些结果表明，端粒的加帽和脱帽是由RNF8和FBW7通过TPP1不同氨基酸残基泛素化来调节的。RNF8介导的232K残基泛素化可提高TPP1的稳定性，FBW7介导的299K、453K和459K残基多泛素化调节TPP1降解。为了证明FBW7在正常人和鼠肺上皮细胞端粒脱帽中的作用，实验发现FBW7-KD降低了端粒脱帽水平，p21和p16促进细胞增殖。FBW7-KD还消除了IR诱导的端粒脱帽、p21和p16的增加，以及细胞增殖的减少。结果表明FBW7对基础和应激条件下人和小鼠细胞中TPP1缺失、端粒脱帽和缩短有显著作用。

当FBW7α或γ在IR的情况下触发端粒功能障碍和诱导细胞衰老时，过表达TPP1抑制IR或FBW7诱导的细胞TIFs和b-Gal的增加。在体内，过表达FBW7α诱导TPP1缺失，端粒缩短和AEC2干细胞衰老，最终导致肺纤维化和呼吸功能障碍。气管内过表达TPP1改善呼吸功能，增加了静息状态下的AEC2干细胞数量，防止FBW7诱导的干细胞数量减少以及HP1γ+细胞增加。增加TPP1完全抑制FBW7诱导的端粒缩短和肺纤维化。同样，过表达TPP1抑制BLM诱导的肺纤维化和呼吸功能障碍，增加AEC2干细胞数量，减少HP1γ+细胞和TIFs，延长端粒，抑制肺纤维化。这些结果表明，TPP1具有支持AEC2干细胞增殖、肺呼吸功能和抵抗应激诱导的早衰和纤维化的作用。

总之，文章提供了一种新的针对应激性疾病预防和早衰及相关疾病治疗干预的思路。研究表明FBW7 / TPP1轴在调节端粒稳态、加帽和脱帽中起关键作用，从而调控干细胞命运。FBW7与TPP1相互作用包含FBW7中含有聚精氨酸簇WD40结构域，TPP1丝氨酸/苏氨酸区中CPD磷酸化以及各种TPP1泛素化位点，为干细胞增殖调控和肿瘤发生干预提供依据。最后，用TELODIN建立小鼠肺衰老和纤维化模型证明FBW7预防应激性衰老及相关疾病的作用。