Inactivation of the ferroptosis

本文选择nature cell  biology   2014，DOI: 10.1038/ncb3064，喜欢的朋友可以自行下载阅读。

摘要：铁死亡是一种非凋亡形式的细胞死亡，由特定肿瘤类型的小分子和过度表达癌基因的非工程细胞诱导。在这里，我们提供了直接的遗传学证据表明敲除谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)在病理相关的铁死亡中导致细胞死亡。利用可诱导的gpx4−/−小鼠，我们阐明了谷胱甘肽/Gpx4轴在预防脂质氧化诱导的急性肾功能衰竭和相关死亡中的重要作用。我们进一步系统地评价可能有效抑制铁死亡的小分子抑制剂,这里我们发现了Liproxstatin-1,在细胞,能够抑制Gpx4−−老鼠铁死亡和缺血再灌注引起的肝损害。总之，我们证明了铁死亡是一种普遍和动态的细胞死亡形式，当其受到阻碍时，可以对细胞起到保护作用。

作者这篇文章基于自己2008年的文章基础，在MEF细胞中敲除GPX4可以诱导ALOX15、AIF依赖的细胞死亡，

所以进而转移到动物上，想在体内实验中验证同样的想法，作者构建了条件敲除GPX4转基因小鼠。想进一步评价GPX4-ALOX15轴在细胞死亡中的作用。作者构建了两种敲除鼠，在条件敲除GPX4基础上一种敲除ALOX15,一种没有敲除。并且进行了实验验证一番

然后再PZ中敲除ALOX5，和PZL一样，也会导致细胞死亡，所以，没有单独的脂氧合酶可以被鉴定为单独负责Gpx4失活下游的细胞死亡过程。

为了了解GPX4敲除后导致死亡的原因，作者解剖了小鼠，发现肾脏明显改变，并且在TAM治疗后7天GPX4明显降低，并且出现非选择性蛋白尿（F图）（这就很神奇）

一波HE和组化后发现小鼠肾小管出现了明显的凋亡，但是ALOX15敲除并没有使肾小管损伤加重或者减轻。

既然细胞死亡了，作者进一步证明细胞死亡方式是什么，老生常谈了

作者对NEC1（坏死性抑制剂，作用靶点RIP1）保护细胞免于坏死和铁死亡很好奇，所以就看看NEC下游基因RIP1/3的功能，RIP3显示出对GPX4清除的保护作用。显示RIP1/3既不能保护PFA在GPX4敲除引起的铁死亡，也不能保护L929细胞在RSL3诱导下的死亡,即使敲除了RIP1也没有改变RSL3的敏感性。因此说明一个问题NEC1对抗铁死亡上还有其他潜在靶点。

有趣的是NEC确实可以保护细胞免于铁死亡

换用更加特异性的RIP1抑制剂却没有能够起到保护作用。

作者为了证明GPX4敲除引起铁死亡，又做了进一步形态学验证，Gpx4-/-细胞表现出线粒体肿胀，嵴数量减少，具有更层状的表型，自噬体增加。

既然脂质过氧化是铁死亡的主要特征，尽管这些分子本身、产生方式和位置仍不清楚。以前，我们报道过gpx 4-/-细胞在其脂质室中表现出一种尚未被表征的强氧化成分，既然线粒体形态变化这么明显，那么会是线粒体产生的致死性脂质信号吗？作者惊奇的发现脂质过氧化信号发生在细胞死亡以前，并且线粒体的脂质过氧化信号没有改变，说明这种致死性脂质信号来源于线粒体外成分。（这里C图为什么用这两个药，大家可以翻翻我前面写的，高分文章与生俱来的严谨）（还有一点作者可能自己都没想到，如果用erastin诱导，这篇文章可能就会是另一种场景了，为什么？不懂可以看看我以前写的。文末有解析）

ε=(´ο｀*)))唉，这会不会说明erastin发挥作用主要是在XCT，而并不是VDAC2/3

据报道，富含花生四烯酸的膜加速了Gpx4缺失的细胞死亡过程。因此，作者测定了细胞培养基中释放的花生四烯酸代谢物

用5-、12-和15-氢过氧二十碳四烯酸(HpETEs)处理gpx4/-细胞加速了铁死亡过程，而其他代谢物，包括HETEs和氧二十碳四烯酸，不影响细胞死亡。

因为针对线粒体的抗氧化剂也可以抑制铁死亡，所以，作者猜测可能是线粒体膜上的脂质转运体，特别是SCP-2,在其中发挥了传播氧化应激的作用。

在细胞中敲除SCP2也发挥了拮抗GPX4敲除的铁死亡效应。

既然脂质在这个过程中起到重要作用，作者进一步进行了脂质组学鉴定，然后打了质谱。由于Gpx4催化双氧磷脂还原为单氧磷脂，在第6天(未检测到肾衰竭表现)和第10天(出现明显的肾衰竭表型)对对照与Gpx4-/-动物的肾脏中的这些相应物种进行了液相色谱-质谱评估(图5)。为了验证双氧物种的性质，用温和的还原剂三苯基膦处理脂质提取物，将氢过氧(OOH)转化为相应的羟基(OH)。Gpx4-/-小鼠中磷脂的二氧化物种由OOH表示，并且在Gpx4耗尽后的第10天，它们在PC和PE中的水平显著更高。

接下来，重点研究了线粒体特异性磷脂CL-羟基衍生物，它被认为是优选的Gpx4底物。与第10天相比，在第6天的gpx4/肾脏中检测到显著更高含量的CL-羟基化合物。此外，在这两个时间点，CL-羟基乙酸的水平明显高于对照组小鼠。此外，在这两天，Gpx4-/-小鼠积累了更多的单溶血CL(mCL)以及游离脂肪酸的氢过氧分子，包括亚油酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸。仅在第10天可检测到Gpx4-/-小鼠肾脏中溶血卵磷脂(LPC)和溶血磷脂酰胆碱(LPE)蓄积的显著变化。因为氧化的PLs是细胞溶质和线粒体aiPLA2的优选底物，作者推测mCL的显著积累可能解释了在Gx4破坏中观察到的破坏形态变化。

作者既然发现了GPX4缺陷鼠出现肾衰竭是由于铁死亡导致，并且在这个过程中出现的脂质代谢异常以及SCP在传递氧化应激信号的作用，因此，作者筛选了小分子抑制剂文库，想找到一种可以抑制铁死亡的药物，Liproxstatin-1可防止BODIPY 581/591 C11氧化细胞，这种针对铁死亡的保护作用具有特异性。

最后，作者在人的肾小管上皮细胞以及一个肝的缺血再灌注模型中确认了以上发现

文章到此结束，总的来说发现了NEC具有抗铁死亡的作用的，但是靶点未明确，首次证实了铁死亡中脂质代谢异常的种类，发现了一个新的抗铁死亡的药物，间接证明了肝脏缺血再灌注损伤涉及铁死亡过程，欢迎批评、指正。