高通量测序原理

2018-10-13 本文已影响122人 tobebettergirl

测序类型

ROCHE/454 测序
illnumina 测序
Pacbio 测序
nanopore 测序

主流的NGS测序技术：Roche/454 、Illumina/HiSeq 2000 、 Applied Biosystems/SOLID.Illumina 的测序技术
其中* Applied Biosystems/SOLID.Illumina*最为成熟。

目前基本不用 Roche/454

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一、Illumina测序

1：主要流程

提取核苷酸
质量评估
连接接头
文库定量
将模板链杂交到测序反应面上
扩增模板序列
线性化
固定测序引物
边合成边测序
碱基判读和分析结果

以HiSeq系列为主。它的机器采用的都是边合成边测序的方法，主要分为以下4个步骤：

300bp-800bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头

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测序流动槽（flowcell）

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桥式PCR扩增与变性

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测序

添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。
dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序过程中，一次只会被添加一个碱基。同时在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。
这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。

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单端Index
双端Index

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二、Pacbio测序

零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。

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测序原理

文库构建是将长片段DNA分子与测序接头连接形成茎环结构
加上与接头互补的测序引物及DNA聚合酶分子；上机测序是将构建好的文库复合物放入PacBio RS测序仪上，并载入测序芯片SMRT Cell的纳米孔中，DNA聚合酶分子通过共价结合固定在纳米孔底部，通常一个纳米孔固定一个DNA分子。
在SMRT Cell芯片孔中，加入DNA聚合反应所需底物dNTP及缓冲液，4种dNTP带有四色荧光标记基团。
根据模板链核苷酸顺序，相应的dNTP进入DNA模板链、引物和聚合酶复合物中发生链延伸反应，同时dNTP荧光信号通过零模波导（zero-mode waveguide，ZMW）检测获得荧光信号图像，经计算分析得到DNA碱基顺序。