RNA pull down 原理与操作步骤
原理：
RNA pull-down其目的是检测与RNA互作的蛋白。实验过程简单来说就是把感兴趣的RNA进行体外转录，并标记（如生物素标记），再与细胞裂解液共同孵育，形成RNA-蛋白质复合物，然后将分离得到蛋白质，通过WB 或 质谱进行验证或鉴定。
实验步骤：
l体外转录模板制备
1.设计扩增目的基因的引物，并带上T7 promoter序列的如下表（表中红色部分序列为T7 promoter序列）：
基因名称引物名称引物序列
GAPDH-SenseFaaaaTAATACGACTCACTATAGGGTGTTGCCATCAATGACCCCTT
RCTCCACGACGTACTCAGCG
GAPDH-AntisenseFTGTTGCCATCAATGACCCCTT
RaaaaTAATACGACTCACTATAGGGCTCCACGACGTACTCAGCG
2.构建目的基因载体，并用带T7 promoter序列的引物扩增，进行琼脂糖凝胶回收。回收产物用作体外转录模板。
l体外转录&生物素标记RNA
1、取一支无RNA酶的EP管，按如下表加入转录体系，37℃孵育35min。
DNA模板1ug
Biotin RNA Labeling mix2µl
10×Transcription buffer2µl
T7 RNA Polymerase
RNase Inhibitor
0.5µl
1µl(40U)
补足RNase-free水至20µl
2、取出孵育好的EP管，加入1µl的DNaseⅠ，37℃孵育15min，除去DNA模板。(取出上述操作的EP管，加入2µl0.2M EDTA（pH=8.0）终止反应。
3、加入180ul RNase free 水，并加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1),涡旋混匀。
4、12000 转，4℃离心10min;
5、转移上层水相到新的离心管，加入0.1V的3M醋酸钠（PH:5.2）;2.2V的无水乙醇，6uL糖原；颠倒混匀后，-20℃沉淀过夜；
6、12000 转，4℃离心10min;并用500uL70%乙醇洗涤沉淀；
7、室温静置2~5min，晾干乙醇后加入30ul的DEPC处理水溶解RNA，并用超微量紫外分光光度计测定RNA浓度。
8、取3µg Biotin标记的RNA（补充水至：25ul），95℃加热2min，立刻冰浴2min;加入25ul Structure Buffer，室温静置20min。
l样本前处理：
1.用1ml 4℃预冷的RLN 悬浮细胞（加入 RNaseinhibitor及蛋白酶抑制剂）冰上孵育５min;
2.1450 × g, 4 ℃, 离心２ min，去上清；
3.用100ul 预冷的RLN洗涤１次（不能悬浮沉淀）；
4.用170ul预冷的 protein lysis buffer 重复悬浮细胞（超声10s停10s；６次）；然后涡旋30s，并吹打混匀；
5.冰上孵育30 min
6.17000×g, 4 ℃，离心15 min；取150ul上清，-80℃冻存备用。
lDynabead™ MyOne™ 链霉素亲和素 C1处理步骤：
1.涡旋震荡磁珠40s，混匀磁珠
2.分装50ul磁珠的1.5mL离心管中；
3.磁力架上放置1min，弃上清；
4.用1mL的Solution A洗涤磁珠两次，每次2min;
5.用等体积的Solution B 洗涤磁珠一次
6.20 mM Tris (pH 7.5) 洗涤两遍
7.加入50 μL RNA capture buffer 重悬磁珠
8.加入50 pmol生物素标记RNA（3ug）;室温颠倒孵育15min;
9.磁力架上放置3min,去上清
10.用50 μL of 20 mM Tris(pH 7.5)洗涤两遍；
11.用100 μL of 1× protein–RNA binding buffer洗涤１次；
l RNA PULL DOWN
1.配制protein master mix:150ul上清，加入30ul丙三醇，20ul 10x protein–RNA binding buffer
8.分装100ul protein master mix到RNA－磁珠复合物中；４℃翻转孵育１ｈ；
9.磁力架上放置1min，弃上清；
10.１X wash buffer (100µL)，洗涤３次
11.加100ul elution buffer 悬浮磁珠。
12.加入25ul 5×蛋白鉴定loading buffer;沸水煮10min。
13.银染检测pull down 效果；然后进行WB验证或质谱鉴定
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