单基因结合免疫浸润的新思路
今天跟大家分享的是2020年3月发表在Aging（IF：5.515）杂志上的一篇文章Immune-related key gene CLDN10 correlates with lymph node metastasis but predicts favorable prognosis in papillary thyroid carcinoma。在文章中作者基于TCGA-THCA队列，通过DEGs的筛选，然后作功能注释、预后分析，最后筛选到TCGA-THCA免疫相关的关键基因CLDN10，是不是很熟悉的配方呢？
Immune-related key gene CLDN10 correlates with lymph node metastasis but predicts favorable prognosis in papillary thyroid carcinoma
免疫相关关键基因CLDN10与甲状腺乳头状癌淋巴结转移相关且预测良好预后
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一.研究背景
甲状腺癌是世界上最常见的内分泌恶性疾病。甲状腺乳头状癌(PTC)是最常见的一种。PTC与免疫细胞浸润与淋巴结转移密切相关。在这些生物学过程中，免疫相关基因可能通过影响浸润免疫细胞的丰度来影响癌症患者的预后。因此，必须识别特定表型癌症的免疫相关基因，以阐明确切的机制，并为癌症诊断和治疗寻找生物标志物或靶点。
二.分析流程
三.结果解读
1.免疫score、基质score与临床特征的关系
作者根据ESTIMATE算法计算TCGA-THCA队列的免疫和基质score，并展示了其他临床信息（表1）。
免疫score和基质score按中位分为高、低两组，作多因素Cox分析（表2）。
作生存分析，评估免疫和基质score的预后价值。不过免疫score或基质score对预后无显著影响(P>0.05，图1A：a为免疫score；b为基质score)。
表1.来自TCGA数据库的患者特征
表2.免疫score、基质score与临床病理因素的关系
2.免疫score和基质score相关的差异表达基因(DEGs)的鉴定以及DEGs的功能注释
基于免疫score、基质score的高低分别作基因差异表达（图1B）。
此外，进行Venn分析以缩小与免疫细胞和基质细胞相关的靶基因的范围。数据显示交集有1003个基因表达上调，5个基因表达下调（图1C）。然后作者着手这些基因进行进一步分析。
基于GO和KEGG途径富集分析，对所筛选的DEGs作功能注释（图1D）。
图1.TCGA队列生存分析以及DEGs的功能注释
3.TCGA-THCA中DEGs的预后价值和LNM相关中心基因的构建和鉴定
对TCGA-THCA队列进行单变量cox回归分析。在评估的1008个DEGs中，有87个基因预后价值显著。(P<0.05;表3)。
将1008个DEGs纳入共表达网络分析。
首先确定最优的软阈值：如图2A所示，当power value设置为9时，scale independence value为0.9，此时的平均连通性值较低。
接着用层级聚类树展示各个模块：结果显示了4个模块，包含了194个基因（蓝色）、126个基因（棕色）、15个基因（灰色）和671个基因（绿色）。
对与LNM相关的模块(蓝、棕、绿)进行了评估。与模块高度相关的基因分析显示，蓝色模块相关性显著(r=0.38, P=4.6e-08；图2C)。
表3.DEGs的单变量Cox回归分析
图2.DEGs的WGCNA
4.关键基因的筛选
通过以下步骤筛选TCGA-THCA中与免疫相关和与LNM相关的关键基因：
首先，选择了表3中87个具有PTC预后价值的基因(免疫相关)。
其次，选择GS（gene significance）值大于0.15的蓝色模块中的20个基因(LNM相关)。
第三，通过Venn分析得到这些基因的交集。CLDN10被筛选为可能与免疫和LNM相关的关键基因（图2D）。
5.CLDN10表达的评估
提取TCGA-THCA队列中CLDN10的表达数据。根据中位水平将CLDN10的表达水平分为高、低两组。表4列出了CLDN10表达情况与临床特征信息。CLDN10高表达时，可能伴随低年龄、高T分期、LNM等特征。
表4.CLDN10表达与临床病理因素的关系
从GEO提取GSE35570来评估CLDN10表达的诊断和预后价值。
图3A:ROC曲线的AUC为0.954，提示CLDN10可作为区分TCGA-THCA病例的潜在生物标志物。而且KM生存分析结果显示CLDN10低表达患者的OS更长。
图3B：免疫组化（IHC）检测PTC组织及邻近正常组织中CLDN10的表达，显示肿瘤CLDN10的表达显著高于癌旁组织。
图3C：CLDN10的高表达与LNM联系显著(P<0.05)；而与年龄、T分、临床分期无显著联系(P>0.05)。
图3.CLDN10表达与预后的关系
6.CLDN10表达与免疫细胞浸润水平的关系
用TIMER算法来确定CLDN10表达与免疫细胞浸润之间可能存在的联系。
图4A显示了CLDN10表达与肿瘤纯度呈弱的负相关性；相反，与B细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞的浸润水平呈显著正相关。
图4.CLDN10的与免疫细胞浸润的联系
接着进行多变量Cox回归分析（表5）。
发现CD8+T细胞(HR=0.000, 95%CI= 0.000 - 0.032)和巨噬细胞(HR=0.000, 95%CI= 0.000 - 0.152)可能是降低癌症风险和延长患者总体生存时间的良好独立预后指标。
表5：多因素Cox分析CLDN10的表达和其他临床预后标志物
7.CLDN10表达与免疫细胞标志物的关系
用免疫细胞标记物来进一步研究CLDN10表达与CD8+T细胞和巨噬细胞的关系。
结果显示：CLDN10的表达分别与CD8+T细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞的细胞标志物呈正相关（图4B，表6）。
表6：CLDN10与相关免疫细胞相关基因标记的相关性研究
本文基于TCGA-THCA队列，利用ESTIMATE算法对基质和免疫评分进行评估，筛选出DEGs。然后作功能注释、预后分析以及WCGNA。将WCGNA筛选的基因与DEGs作Venn取交集，最后筛选到TCGA-THCA免疫相关的关键基因CLDN10，并验证了其诊断、预后价值。
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