如何进行DNA甲基化的研究

实名制感谢韩医生在DNA甲基化的知识点上对我熏陶。

甲基化的研究，总的来说大致可以分为三大类：

1.DNA甲基化，这一类是研究最多，修饰也最为稳定的类型；

2.组蛋白的甲基化修饰，以及乙酰化

3.RNA甲基化的修饰，虽然RNA的修饰有100多种，但主要以A碱基上的6mA甲基化修饰为主。

那么，什么是DNA甲基化修饰呢？简单的讲，就是在DNA上胞嘧啶发生了一个甲基基团的修饰，看图。

因此，提到DNA甲基化的时候，我们也会说5mC甲基化。别看这只是一个小小的改变，它所起到的作用却是巨大的！有些科学家甚至将DNA甲基化叫做“第五种碱基”！

DNA甲基化的作用

那么第二个问题就来了，这有什么作用呢？

简单来说，DNA甲基化可以调控基因的表达。以高等动物为例，每个个体从一个受精卵发育成成体的过程中，DNA甲基化都是不同的，会调控不同的细胞往不同的方向分化。比如，哪些细胞群变成大脑，哪些变成心脏，都和它有着密切的关系。

另外一个方面，当我们长大了，如在抑癌基因上某个区域的甲基化升高，就会导致基因的表达降低，进一步就会诱发癌症风险，反之，如果在致癌基因调控趋于的DNA甲基化变低，也有可能导致癌症等各种疾病的发生。

在人以及各种哺乳动物中，很多C和G连续的碱基上会发生DNA甲基化，而与C相邻的其他碱基则不会，这种现象与DNA甲基化修饰酶有一定的关系。

在人的基因组上，有很多CG碱基聚集的地方，我们称之为CpG岛，这个地方往往是低甲基化的，如果甲基化发生了改变，就会导致后面的基因无法表达，进而就会有一系列问题了。所以在大量的文献中，CpG岛的甲基化修饰一直是研究重点。

现在又有了CpG 海岸的概念。什么意思呢？就是科学家们发现，除了CpG岛会出问题，岛旁边的位置也很容易发生改变！

在很多研究中，大家都会关心DNA甲基化是不是导致基因表达变化了，而很多转录起始位置附近也会有CpG岛，所以我们也常常会把研究的焦点集中于转录起始位置的启动子区域。

除了发现DNA甲基化会调控基因表达，也有发现表明，外显子和内含子的DNA甲基化异常也会导致不同的可变剪切，这个也是一个重要的研究内容。

研究方法与技术手段

知道了DNA甲基化的作用，那研究DNA甲基化的技术手段有哪些？

简单的说，可以分为两大类。

一类是IP类的，代表作就是DNA甲基化免疫共沉淀技术（MeDIP-seq），当然还有专门富集CpG的MBD技术，不过研究的不多。IP类技术的分析DNA和RNA的分析技术类似。

另外一类叫重亚硫酸盐处理技术。Bisulfite技术本身非常简单，就是把没有甲基化的C变成了T，不过其延伸出来的技术种类五花八门，比如：

全基因组DNA甲基化技术（WGBS）

酶切全基因组甲基化技术（RRBS）

双酶切技术

启动子液相捕获DNA甲基化芯片技术（LHC-BS）

精确DNA甲基化技术（oxBS）

另外，这里要重点说一下精确DNA甲基化技术。什么是精确？比如，在动物体内，DNA甲基化是一个动态变化的过程，不仅有DNA甲基化过程，也有TET酶参与的去甲基化过程。在去甲基化的过程中，甲基基团首先会被氧化成羟基，这个羟基在后续会进一步被氧化成醛基、羧基，然后就变成无官一身轻的胞嘧啶了。

重亚硫酸酸盐处理以后，醛基修饰的胞嘧啶，羧基修饰的C，还有没有甲基化的C全部都会变成胸腺嘧啶T。传统的bisulfite技术是无法区分甲基化和羟甲基化的，而精确DNA甲基化技术是通过某种重金属，把羟基给氧化了，这样后续处理的时候，也会变成T，而剩下的就只有甲基化胞嘧啶C了。所以通过这个技术，可以将羟甲基化单独拎出来研究。

目前，比较成熟的氧化甲基化技术（oxBS）是由CEGX公司推出的，该技术可以稳定的将羟甲基化修饰给氧化掉，最终经过bisulfite转化成T。

说完了技术手段，接下来我们讨论一下各种技术的优劣式。

先说准确性。现在研究DNA甲基化，最准确的自然是重亚硫酸盐处理，这种手段可以精确的看到每个胞嘧啶位点上的甲基化修饰情况。对于经费充足的实验室，重亚硫酸盐处理技术中的WGBS技术是首选，此技术可以覆盖全基因组，一般要求30X，比如人的基因组差不多需要90G的数据量。考虑到测序成本，此技术更适合经费充足的实验室。

WGBS技术也适合某些做植物研究的实验室，比如，像黄瓜等基因组很小的物种（只有几百M），测序成本很低，就没有必要采用其他技术来做了。对于基因组大的植物物种，可以考虑用MeDIP，或者双酶切RRBS评估一下，是否可行。

对于精度要求更高的，比如只研究精确的DNA甲基化的修饰情况，或者是想研究羟甲基化的修饰情况，oxWGBS是首选，它的成本也相对比较高。此类技术的应用限制，现阶段来说就是测序成本较高。

其他研究定量甲基化的技术，都是只研究基因组上一部分的甲基化的修饰情况，代表技术有RRBS（基于酶切），LHC-BS（基于液相捕获），以及现在临床应用比较多的850k/450k甲基化芯片。

RRBS和LHC-BS是基于测序技术，研究的CpG位点数大概都是在2M左右，也是基于测序技术研究大规模样品常用的工具之一，数据量一般8-10G。

RRBS研究的区域是全基因组上的酶切位点，如RSPI酶的CCGG位点等。不过此类技术在现有读长PE150的背景下会浪费很多数据（因为有效的酶切区域片段为40-220，现有测序技术会被测通，从而导致大量数据被浪费）。

而LHC-BS的优势在于可以覆盖基因组上绝大多数的启动子区域（95%），全部的CG岛和CpG shore区域，但是对实验操作者的水平要求较高，一般捕获效率在50%-60%。此条件下，8G的数据量，在人的样品中目标区域60M，可得到的实际深度为50~60X，和BS技术对比吻合度也比较好，对现阶段大规模DNA甲基化样品研究而言，还是一个值得选择的工具了。

再有就是450k甲基化芯片和850k甲基化芯片，这两款芯片是基于荧光定量来鉴定DNA甲基化的，和测序的结果吻合度也较好，但问题在于检测位点数太少，且现阶段的成本也不便宜，与RRBS和LHC-BS相比成本也低不了太多。

看图，直观地展示一下这几种技术在各基因元件上的覆盖情况。

参考资料：
1.https://www.jianshu.com/p/74a0b19c0863
2.https://www.jianshu.com/p/ac00b8df4ce0
3.https://mp.weixin.qq.com/s__biz=MzI3MTM3OTExNQ==&mid=2247484677&idx=1&sn=991ebb150540fab07438e4866716d64d&chksm=eac3fac1ddb473d7fe28006defe02faa3111dacdf5c4fbdef7c77fc807910d52868216f0b9a0&scene=21#wechat_redirect